CK-19与GPC-3联合检测在肝细胞癌和胆管细胞癌诊断中的价值

宋微珩 盖赵辉 董鑫 姜淼 孙丽敏

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（GPC-3）是一种癌胚蛋白，主要在发育期间主导细胞形态形成及生长［1］。GPC-3上的糖基磷脂酰肌醇通过结合细胞膜的方式，控制细胞生长以及细胞分化。在胚胎发育期间，GPC-3蛋白表达具有较强的器官组织特异性和分化特异性，其中肝实质细胞在整个孕期有较高的GPC-3蛋白表达，而当婴儿从母体分离后，GPC-3在肝实质细胞则无明显表达［2］。近年来，有报道称细胞角蛋白19（CK-19）是胆管上皮的标志物之一，在胆管上皮细胞有较明显的表达［3］。目前，医学界尚无足够数据证明CK-19可作为诊断某一类肿瘤的特异性指标，但对肿瘤鉴别具有一定的参考价值［4］。因此，本研究通过联合检测GPC-3和CK-19在肝细胞癌和肝内胆管细胞癌表达水平，并分析两者与肿瘤分化程度的关系，探讨GPC-3和CK-19在诊断和鉴别肝细胞癌和肝内胆管细胞癌的价值。现报道如下。

资料和方法

一、一般资料

选取大庆油田总院病理科2011年1月至2013年3月行肝穿刺及外科手术切除的肝癌组织157例，其中肝细胞癌组织85例，胆管细胞癌组织72例。肝细胞癌中男58例，女17例，年龄26-85岁，平均年龄（57.65±15.84）岁，中低分化组织69例，高分化组织16例。胆管细胞癌中男58例，女17例，年龄26～85岁，平均年龄（57.65±15.84）岁，中低分化组织59例，高分化组织13例。两种癌组织在年龄、性别比例、分化程度比较中差异无统计学意义（P＞0.05），一般资料具有可比性。

二、材料

鼠抗人GPC-3、CK-19购自福建迈新公司，免疫组化SP试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司。

三、方法

所有标本经10%的甲醛固定，脱水、浸蜡、包埋，4um厚度连续切片。随后进行苏木素－伊红（HE）染色。染色完毕后进行烤片、脱蜡，并放置于乙醇溶液。加入3%H2O2溶液静置5分钟。采用PBS缓冲液浸泡3次，每次5分钟。放入PH6.0的柠檬酸缓冲液高压高温修复。修复后，置于水中冷却至37℃，再次采用PBS缓冲液冲洗3次。加入鼠抗人GPC-3，置于4℃冰箱过夜，PBS缓冲液冲洗3次，37℃下加入二抗PV6 000 10分钟，PBS缓冲液冲洗3次。然后进行DAB显色，终止染色，脱水，并加入二甲苯，封片。最后置于显微镜下观察，GPC-3阳性表达信号为黄色或棕黄色。CK-9免疫组化染色步骤与GPC-3基本一致，唯一区别就是CK-19进行高压高温修复后，先在37℃下采用胃酶消化1分钟，随后步骤与GPC-3一致。CK-19阳性表达信号为黄色或棕黄色。

四、统计学处理

采用SPSS17.0进行数据分析，计数资料采用百分比的形式表示，组间比较采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、GPC-3、CK-19在肝细胞癌、胆管细胞癌及癌旁正常组织中的表达

在GPC-3免疫组化检测中，肝细胞癌组织中检测出75例阳性，阳性表达率高达88.24%，而胆管细胞癌组织中仅有11例表达阳性，阳性表达率为15.28%，两种组织阳性表达率比较差异有统计学意义（P＜0.01）。在CK-19免疫组化检测中，肝细胞癌表达均为阴性，胆管细胞癌组织却呈现高阳性表达，表达率为94.44%，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

图1 A.GPC-3在肝细胞癌中的阳性表达；B.CK-19在胆管细胞癌中的阳性表达

表1 GPC-3、CK-19在肝细胞癌、胆管细胞癌及癌旁正常组织中的表达（例）

二、GPC-3与肝细胞癌肿瘤分化程度的关系

在肝细胞癌中，GPC-3在中低分化组织中的阳性检出率为97.10%，明显高于高分化组织阳性检出率的50.00%，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 GPC-3与肝细胞癌肿瘤分化程度的关系（例）

三、CK-19与胆管细胞癌肿瘤分化程度的关系

在胆管细胞癌中，CK-19在中低分化组织中的阳性检出率为100.00%，明显高于高分化组织阳性检出率的69.23%，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表3 CK-19与胆管细胞癌肿瘤分化程度的关系（例）

讨 论

肝癌是指发生于肝脏的原发性恶性肿瘤和转移性恶性肿瘤，根据形态学及细胞遗传学对肝癌的定义，肝癌主要分为3种，分别为肝细胞癌、胆管细胞癌以及肝细胞癌合并胆管细胞癌［5］。肝细胞癌和胆管细胞癌最为常见，也最难区分［6］。近年来，GPC-3作为肝癌标志物被广泛报道。据金光植研究［7］显示，GPC-3在肝癌组织呈高表达，而在癌旁正常组织基本无表达。而国外学者Di Tommaso L等［8］研究结果进一步表明，GPC-3对于肝癌诊断的敏感度为69%，特异度为91%，甚至在AFP为阴性的肝癌患者中，GPC-3蛋白也呈较高的表达。本研究中，GPC-3在肝细胞癌组织的阳性表达率高达88.24%，明显高于胆管细胞癌的15.28%，实验结果与上述研究一致。GPC-3在肝细胞癌呈高表达，在胆管细胞癌呈低表达，其可能的原因为：肝癌祖细胞逐渐向肝癌细胞转化，少数 GPC-3在胆管来源的细胞中表达［9］。而GPC-3在中低分化的肝细胞癌组织中的阳性表达率明显高于高分化的肝细胞癌组织，这提示了GPC-3在肝细胞癌阳性表达与肿瘤的恶性程度有关，可作为早期诊断和判断预后的指标之一。

Jain R等研究［11］指出CK-19是胆管上皮的标志物，CK-19可表达于增生性的胆管上皮、良性胆管细胞瘤及胆管细胞癌中。本研究还发现CK-19在大部分的胆管细胞癌组织中呈阳性表达，但在肝细胞癌中却均呈阴性。这点与Jain R等研究相符合。CK-19属于胆管细胞型细胞角质素，仅在胆管上皮来源的细胞中表达［12］。因此，笔者推测高表达的CK-19肝癌患者属于胆管细胞癌的可能性较大。而CK-19在中低分化的胆管细胞癌组织中的阳性检出率明显高于高分化组织，进一步提示了CK-19在胆管细胞癌中的阳性表达与胆管细胞癌侵袭性有关。这与张世杰［13］报道的低分化胆管细胞癌与高分化胆管细胞癌相比，CK-19甚少在高分化胆管细胞癌表达一致。因此，CK19表达可作为早期肝癌复发的诊断指标，对肝癌预后情况判断有参考价值。

综上所述，GPC-3在肝细胞癌中呈现高表达，而CK-19仅在胆管细胞癌表达，联合检测CK-19与GPC-3对鉴别诊断肝细胞癌和胆管细胞癌有参考价值。

1 范钦桥，陈书伟，陈小雪，等.GPC-3 mRNA与GGT联合检测诊断AFP阴性原发性肝细胞肝癌.中国普通外科杂志，2013，22：59-62.

2 Yao M，Yao DF，Bian YZ，et al.Oncofetal antigen glypican-3 as a promising early diagnostic marker for hepatocellular carcinoma.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2011，10：289-294.

3 Nakano K，Orita T，Nezu J，et al.Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells.Biochem Biophys Res Commun，2009，378：279-284.

4 姚敏，杨君伶，蔚丹丹，等.sICAM-1和GPC-3 mRNA对肝癌诊断与转移监测的临床价值.世界华人消化杂志，2012，20：1927-1932.

5 Yan D，He Q，Chen Y，et al.Detection ofα-fetoprotein and glypican-3 mRNAs in the peripheral blood of hepatocellular carcinoma patients by using multiple FQ-RT-PCR.J Clin Lab Anal，2011，25：113-117.

6 Di Tommaso L，Franchi G，Park Y N，et al.Diagnostic value of HSP70，glypican3，and glutamine synthetase in hepatocellular nodules in cirrhosis.Hepatology，2007，45：725-734.

7 金光植，顾怡瑾，喻昊，等.AKR1B10联合GPC-3在肝细胞癌免疫组化诊断中的应用.第二军医大学学报，2012，33：625-628.

8 Wang ZS，Wu LQ，Yi X，et al.CK19 can be used to predict the early recurrence and prognosis of HBV-related hepatocellular carcinoma patients with low AFP serum concentration after R0 radical hepatectomy.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2012，34：753-758.

9 王为东，李玉军.肝细胞肝癌中端粒酶、p53和CK19的表达及意义.临床与实验病理学杂志，2012，28：862-866.

10 张珍妮，匡志鹏，杨帆，等.肝癌干细胞表面标志物CK19在化学诱癌过程中的差异表达.肿瘤防治研究，2012，39：1188-1192.

11 Jain R，Fischer S，Serra S，et al.The use of Cytokeratin 19（CK19）immunohistochemistry in lesions of the pancreas，gastrointestinal tract，andliver.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2010，18：9-15.

12 Bioulac-Sage P，Balabaud C.Perinodular CK19 loss in hepatocarcinogenesis.Clin Res Hepatol Gastroenterol，2011，35：783-785.

13 张世杰，郎振为，王欣欣，等.联合应用磷脂酰肌醇蛋白多糖－3（GPC-3）和细胞角蛋白-19（CK-19）免疫组化检测在肝细胞肝癌诊断和鉴别诊断中的价值.首都医科大学学报，2011，32：653-657.