合欢皂苷颗粒剂对高原鼠兔的抗生育作用

舒 杨，殷中琼，赵 建，李 平，李太强，龙兴发，朱链发

(1 四川农业大学 动物医学院，四川 雅安625014；2 四川大学 生命科学学院，四川 成都 610064；3 四川省甘孜州畜牧业科学研究所，四川 康定 626000)

合欢皂苷颗粒剂对高原鼠兔的抗生育作用

舒 杨1，殷中琼1，赵 建2，李 平3，李太强3，龙兴发3，朱链发3

(1 四川农业大学 动物医学院，四川 雅安625014；2 四川大学 生命科学学院，四川 成都 610064；3 四川省甘孜州畜牧业科学研究所，四川 康定 626000)

【目的】 研究合欢皂苷颗粒剂对高原鼠兔的抗生育作用，确定最佳用量，为高原鼠兔种群数量的控制提供参考。【方法】 用主药量为135，270和540 mg/kg的合欢皂苷水溶液灌胃小鼠，进行抗小鼠生育力试验，确定效果后换算为高原鼠兔的相应剂量，制备成合欢皂苷质量分数分别为0.3%，0.6%和1.2%的颗粒剂，并进行摄食系数研究，筛选出抗生育效果与适口性均良好的剂量，研究该颗粒剂对高原鼠兔怀孕率及生殖器官临床剖检和病理学的影响。【结果】 主药含量为540 mg/kg的合欢皂苷抗小鼠生育效果良好，对雄性小鼠的抗生育率可达63%，对雌性小鼠的抗生育率可达70%。通过换算，合欢皂苷质量分数为1.2%的颗粒剂对高原鼠兔的抗生育率达70%，摄食系数可达 1.67。经剖检，可见雄性高原鼠兔输精管充血，睾丸肿大；雌性高原鼠兔出现子宫充血、胎儿吸收等现象。【结论】 合欢皂苷对雌、雄高原鼠兔均具有良好的抗生育作用，其作用靶点主要为生殖器官。

合欢皂苷；抗生育作用；颗粒剂；高原鼠兔

合欢(AlbiziajulibrissinDurazz)为落叶乔木植物，原产于我国和日本。有文献报道，合欢中含皂苷、三萜、黄酮等多种成分[1]，其中主要成分为皂苷[2]。国内有文献报道合欢皂苷具抗肿瘤、抗抑郁、增强免疫等作用[3]。Chaudhary等[4]研究认为，合欢具有抑制雄鼠精子发生的作用。

高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)是一种小型、非冬眠、食草性兔形目动物，广泛分布于海拔3 200～5 300 m的青藏高原及周边高寒草甸草原[5]，特别适合生存于高寒、缺氧的环境[6]，其生活方式为穴居，啃食牧草，挖洞推土，破坏生草层，且繁殖能力强[7]。由于其种群密度过高，近年来造成高山草甸地区家畜(牦牛、绵羊、马等)牧草不足及草地退化等问题，已威胁到当地畜牧业生产的良性发展。因此，探索一种高效、绿色的控鼠手段已成为世界性的课题。由于传统的灭鼠药物对环境污染较大或只是单性不育剂，存在一定的不足，所以研发天然的、可使两性不育的灭鼠剂，对于绿色、科学控制鼠害具有重要意义。

四川农业大学动物医学院基础研究实验室前期研究证实，合欢皂苷对雄性小鼠具有较好的抗生育作用，且合欢在世界范围内被广泛种植，特别是我国南部和西南部地区，其种植面积已相当可观，具有广泛的植物资源[8]。相比其他抗生育剂，合欢皂苷价格低廉，可大批量生产，且已被证实具有抗生育和抗早孕等作用。因此，将其作为有效的防治草原鼠害的植物性抗生育制剂，具有较高的可行性。本研究通过研究合欢皂苷对小鼠的抗生育作用，制备了适应高原鼠兔量的合欢皂苷颗粒剂，并进一步研究了该颗粒剂对高原鼠兔怀孕率及生殖器官的影响，探索合欢皂苷对高原鼠兔的抗生育作用机理，以期为今后将其应用于草原鼠害防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物

合欢皂苷购于陕西慈缘生物科技有限公司，生产批号：CY120512。合欢皂苷颗粒剂由四川农业大学动物医学院基础研究实验室制备[9]。

1.2 试验动物

选用健康性成熟昆明种清洁级小鼠，体质量为25～30 g/只，购于成都达硕生物科技有限公司，合格证号：SCXK(川)2008-24。小鼠常规方法饲养(12 h光照/12 h黑暗，温度(25±2) ℃，空气相对湿度40%～75%)，自由采食。试验前预饲1周，观察小鼠采食和饮水有无异常。

健康性成熟高原鼠兔捕捉于四川省甘孜藏族自治州石渠县生物控鼠示范区，体质量114.3～209.6 g/只，年龄为(4.5±0.5)月。

1.3 合欢皂苷对雄性小鼠的抗生育作用

取健康雄性性成熟昆明种小鼠60只，随机分成3个试验组和1个对照组，每组15只。参考赵建国等[10]关于合欢皂苷的急性毒理学试验结果，低、中、高剂量组雄鼠分别灌胃135 mg/kg(Ⅰ组)、270 mg/kg(Ⅱ组)和540 mg/kg(Ⅲ组)的合欢皂苷水溶液(15 mL/kg)。对照组给予等量生理盐水(15 mL/kg)。连续给药1周后，将雄鼠分别与性成熟雌鼠按1∶2的数量比合笼，每日清晨阴道涂片检查是否交配，发现精子后将雌鼠分笼饲养。雄鼠继续灌胃至19 d，每周根据小鼠体质量调整给药量。于最后一次给药30 min后处死，观察合欢皂苷对雄性小鼠生殖器官的影响，统计各组小鼠的受孕率及抗生育率，抗生育率=对照组怀孕率-试验组怀孕率。

1.4 合欢皂苷对雌性小鼠的抗生育作用

取健康雌性性成熟昆明种小鼠80只，随机分成3个试验组和1个对照组，每组20只。给药剂量同1.3。连续给药1周后，将雌鼠与正常雄鼠按2∶1的数量比合笼，每日清晨阴道涂片检查是否交配，发现精子后将雌鼠分笼饲养。雌鼠继续灌胃至19 d，每周根据小鼠体质量调整给药量。于最后一次给药30 min后处死，观察合欢皂苷对雌性小鼠生殖器官的影响，统计各组小鼠的受孕率及抗生育率。

1.5 合欢皂苷颗粒剂对高原鼠兔摄食系数的影响

由于高原鼠兔属兔形目，与小鼠不同，因此需要根据小鼠的剂量换算后进行试验。以每只小鼠体质量27 g、每只高原鼠兔150 g计算，低、中、高剂量组小鼠19 d摄取主药量分别为135，270和540 mg/kg，其对应的合欢皂苷的有效成分分别为 69.25，138.5和277 mg。根据公式Db=Da·(Kb/Ka)·(Wb/Wa)2/3(Da、Db分别表示每只小鼠、鼠兔的剂量，K表示动物体型系数(小鼠的体型系数Ka=0.089 9，鼠兔的体型系数Kb=0.101 4)，Wa、Wb分别表示每只小鼠、鼠兔的体质量[11])进行换算，制备相应含量的合欢皂苷颗粒剂[9]。经紫外分光光度计测定，低、中、高剂量的颗粒剂中合欢皂苷的质量分数分别为0.3%(Ⅰ组)、0.6%(Ⅱ组)和 1.2%(Ⅲ组)。参照全国农药检定所规定的方法进行摄食系数研究，取健康性成熟高原鼠兔120只，分成3个试验组和1个对照组，每组30只，雌、雄各半，分笼饲养[12]。试验组每个高原鼠兔笼内分别放置不同质量分数的合欢皂苷颗粒剂和普通牧草各90 g，对照组只放普通牧草，让其自由采食，持续7 d，并于每日上午09:00统计各组摄食量，计算摄食系数(摄食系数=摄食抗生育颗粒剂平均量/摄食牧草的平均量)，判断合欢皂苷颗粒剂的适口性[12-13]。判断标准为：摄食系数>0.5，表明适口性优；0.3<摄食系数≤0.5，表明适口性良；0.3≤摄食系数≤0.1，表明适口性中；摄食系数<0.1，表明适口性差[14-15]。以适口性好的颗粒剂进行后续试验。

1.6 合欢皂苷颗粒剂对高原鼠兔的抗生育作用

在甘孜藏族自治州石渠县布设的生物控鼠示范区域进行投药，分为对照区(Ⅱ组，投放普通牧草)、试验区(Ⅲ组，投放合欢皂苷质量分数为1.2%的颗粒剂)和自然受孕区(Ⅰ组，不投任何食物)。投药1个月后，在3个区域内通过捕鼠器分别捕捉高原鼠兔60只(雌、雄各半)，剖检并观察畸形胎或死胎，统计胎子数[16]，计算抗生育率。同时采集雄性高原鼠兔的睾丸、附睾及雌性高原鼠兔的子宫、卵巢，观察并记录高原鼠兔生殖器官的临床变化[17]，然后将其固定于体积分数4%多聚甲醛溶液中，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下检查[1，18]。

1.7 数据处理

应用SPSS 17.0软件对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 合欢皂苷对雄性小鼠的抗生育作用

合欢皂苷对雄性小鼠的抗生育力试验结果见表1。由表1可知，对照组小鼠怀孕率为83%，低(Ⅰ组)、中(Ⅱ组)、高(Ⅲ组)剂量组小鼠的抗生育率分别为50%，56%和63%；与对照组相比，主药用量为540 mg/kg的合欢皂苷抗雄性小鼠生育力作用最明显。

2.2 合欢皂苷对雌性小鼠的抗生育作用

合欢皂苷抗雌性小鼠生育力的试验结果见表2。由表2可知，对照组小鼠怀孕率为85%，低(Ⅰ组)、中(Ⅱ组)、高(Ⅲ组)剂量组抗生育率分别为25%，40%和70%；与对照组相比，主药用量为540 mg/kg的合欢皂苷抗雌性小鼠生育力作用最明显。

2.3 合欢皂苷颗粒剂对高原鼠兔摄食系数的影响

各剂量合欢皂苷颗粒剂对高原鼠兔摄食系数的影响结果见表3。由表3可知，高原鼠兔对合欢皂苷质量分数1.2%颗粒剂(Ⅲ组)的摄食系数最高，且显著高于合欢皂苷质量分数0.3%和0.6%的颗粒剂(P<0.05)。表明合欢皂苷质量分数为1.2%的颗粒剂对高原鼠兔的适口性较好，因此可将其作为合欢皂苷在颗粒剂中的最佳主药含量。

2.4 合欢皂苷颗粒剂对高原鼠兔的抗生育作用

2.4.1 对怀孕率的影响 合欢皂苷质量分数为1.2%的颗粒剂(Ⅲ组)对高原鼠兔的抗生育结果见表4。由表4可知，自然受孕组(Ⅰ组)雌性高原鼠兔怀孕率为93%，对照组(Ⅱ组)雌性高原鼠兔怀孕率为83%，试验组(Ⅲ组)雌性高原鼠兔怀孕率为23%，即抗生育率为70%。

注：同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

注：Different lowercase letters in each column indicate significant difference (P<0.05).

2.4.2 对生殖器官临床剖检的影响 临床剖检观察结果表明，试验组雄性高原鼠兔可见输精管充血(图1-A)及睾丸肿大、充血等现象(图1-B)；雌性高原鼠兔可见子宫充血、出血等现象(图1-C)，甚至可见吸收胎(图1-D)；怀孕的高原鼠兔无死胎或畸形胎现象，且其他脏器无明显病变。

2.4.3 对生殖器官的病理学影响 对照组高原鼠兔睾丸从基膜向内观察，可见处于不同发育阶段的生精细胞、支持细胞和管腔中的精子(图2-A)；试验组高原鼠兔睾丸间质减少，曲细精管萎缩，管腔内各级生精细胞排列疏松，并脱落于管腔中，同时可见管腔内精子减少(图2-B)。

对照组高原鼠兔附睾管管腔完整，可见假复层柱状黏膜，管腔内可见大量精子及分泌物(图3-A)；试验组高原鼠兔附睾管外间质减少，管腔内精子及分泌物几乎消失(图3-B)。

对照组雌性高原鼠兔子宫由内向外可见子宫内膜、子宫肌层及子宫外膜排列紧密，子宫腺具正常形态(图4-A)；试验组高原鼠兔子宫黏膜层、固有层、肌层有不同程度的充血现象，并可见子宫腺增厚(图4-B)。

对照组雌性高原鼠兔卵巢中可见不同发育阶段的卵泡，呈球状，具正常结构、形态(图5-A)；试验组雌性高原鼠兔卵巢中可见血管有充血现象，且成熟卵泡的颗粒细胞溶解，脱落于卵泡腔内(图5-B)。

3 讨 论

本试验结果表明：540 mg/kg的合欢皂苷抗雄性小鼠生育率可达63%，抗雌性小鼠生育率可达70%，该结果为后期的推广示范提供了用量基础，使应用更具可靠性。

鼠类的摄食习性和行为与其对营养的需求有关，决定了鼠类对不同食物的不同嗜好。高原鼠兔长年生活在地下，以植物根茎为食物，防治起来比较困难[14]。摄食系数是评价药物适口性的常用指标，具有较好的客观性，可排除空间和环境因素对害鼠自由采食的影响[9]。本研究表明，高原鼠兔对合欢皂苷质量分数为0.3%，0.6%和1.2%的颗粒剂的摄食系数均大于0.5，适口性较好，且以合欢皂苷质量分数1.2%的颗粒剂适口性最好，可将其作为两性不育灭鼠颗粒剂应用于生产实践。

本试验结果表明，在野外环境中，合欢皂苷颗粒剂对高原鼠兔的抗生育率可达70%。临床剖检中，可见雌、雄高原鼠兔生殖器官病变。本研究发现，合欢皂苷颗粒剂主要引起雄性鼠兔睾丸、附睾精子减少。有研究表明，合欢皂苷可破坏并通过血睾屏障直接杀伤精子，从而使小鼠精子活率降低、畸形率升高；同时，合欢皂苷对睾丸、附睾等生殖器官也有一定程度的损伤，导致雄性不育[19]。国外有文献报道，合欢皂苷可通过减少睾丸、附睾等生殖器官的质量及降低精子活力等途径使雄性大鼠不育，但无明显毒副作用[20]；国内关于合欢皮的报道称，合欢提取物具有显著的抗生育作用；同时，合欢抗生育的有效成分为皂苷，有致流产作用[3]。这与本试验结果相似，说明合欢皂苷颗粒剂具有可靠的抗生育作用。

合欢皂苷颗粒剂对雌性高原鼠兔生殖器官的病理学影响主要表现为引起子宫、卵巢的病理变化，包括对卵泡细胞和子宫各肌层的损伤，如引起各级卵泡细胞胞腔充血，部分卵泡细胞出现核碎裂、核浓缩，炎性细胞浸润；引起子宫不同程度出血、充血、水肿及炎症。蔚冬红等[3]指出，合欢皮的抗生育作用机理在于杀伤胚胎的滋养层细胞。说明合欢皂苷颗粒剂作为抗生育剂可使雌性高原鼠兔生殖器官发生病变，导致其怀孕率降低。但其有关机制还有待进一步研究。

综上所述，合欢皂苷质量分数为1.2%的颗粒剂对高原鼠兔具有良好的适口性，其对雌、雄高原鼠兔均有良好的抗生育作用，具有很好的应用价值，有望应用于草原鼠害的控制。

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Anti-fertility effect ofAlbiziasaponin granules onOchotonacurzoniae

SHU Yang1,YIN Zhong-qiong1,ZHAO Jian2,LI Ping3,LI Tai-qiang3,LONG Xing-fa3,ZHU Lian-fa3

(1CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China;2CollegeofLifeSciences,SichuanUniversity,Chengdu,Sichuan610064,China;3GanziPrefectureInstituteofAnimalScience,Kangding,Sichuan626000,China)

【Objective】 This study investigated the anti-fertility effect ofAlbiziasaponin onOchotonacurzoniaeand determined the optimal dose to improve the control ofO.curzoniae.【Method】 Saponin solution fromAlbiziawas fed to mice with the doses of 135,270 and 540 mg/kg to test the anti-fertility effects on mice.The optimal dose was determined and conversed to corresponding dose forO.curzoniae.Granules with mass fractions of 0.3%,0.6% and 1.2% were prepared and feeding coefficient study was conducted to select the optimal dosage with both good anti-fertility effect and palatability.Then the anti-fertility effect on pregnant rate and pathology ofO.curzoniaewas investigated.【Result】 Saponin fromAlbiziaat the dose of 540 mg/kg had well anti-fertility effect with the anti-fertility rates of 63% and 70% to male and female mice,respectively.The conversed anti-fertility rate againstO.curzoniaewas 70% with the feeding coefficient of 1.67.After necropsy,vas deferens congestion and testis swelling and congestion were observed in males while uterus congestion and absorption embryo were observed in females.【Conclusion】 Saponin fromAlbiziahad strong anti-fertility effect onO.curzoniae,and the main targets were reproductive organs.

saponin fromAlbizia;anti-fertility effect;granules;Ochotonacurzoniae

2013-10-23

公益性行业(农业)专项科研经费项目(201203041)；四川省科技支撑计划项目 (13ZC1635)

舒 杨(1989-)，女，四川成都人，硕士研究生，主要从事鼠害防治研究。E-mail:jessieshuyang@126.com

殷中琼(1968-)，女，重庆人，教授，博士，主要从事天然产物研究。E-mail:yinzhongq@163.com

时间:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.027

S859.83

A

1671-9387(2015)03-0020-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.027.html