细菌培养和聚合酶链反应在肺炎患儿细菌病原学检测中的应用价值

细菌培养和聚合酶链反应在肺炎患儿细菌病原学检测中的应用价值

谭文涛1，笪欣2

(1.新疆独山子石化医院 检验科，新疆 克拉玛依833600；2.新疆克拉玛依中心医院 感染科，新疆 克拉玛依833600)

肺炎是儿童的一种最常见感染性疾病，多发生于婴幼儿，是婴儿死亡的主要原因。多发生于冬春寒冷季节和气候骤变时，夏季也不例外。儿童患病后免疫力低下，容易发生再度感染。其主要临床表现为骤发的发热、呕吐、咳嗽、气促、烦躁及喘憋等症状[1,2]。该病大多数是因细菌感染引起，临床上采用适当的抗菌药可以有效地控制并治愈该病。但随着近年来抗生素的广泛使用和滥用，临床上耐药情况屡见不鲜，多种菌共同感染的现象逐渐增多[3]，儿童肺炎死亡率逐渐升高。临床医师为进一步了解患儿肺炎感染的细菌谱，从而采取准确的对因治疗，常对患儿呼吸道分泌物进行细菌培养以明确菌群，但培养技术存在时间长、培养阳性率低等缺陷而在临床应用上受到一定的限制[4]。目前，国际上出现了一项新技术-聚合酶链反应在临床上得到广泛认可。本研究旨在通过比较细菌培养与聚合酶链反应对肺炎患儿细菌病原学的检测价值，以期为临床肺炎患儿的诊疗提供科学依据。

1资料和方法

1.1　一般资料

参照肺炎诊断标准[5，6]，选择2009年8月至2013年6月本院收治住院的肺炎患儿180例，所有患儿年龄均<10岁，其中男性116例，女性54例，平均年龄(6.20±3.15)月。

1.2　试剂及仪器

试剂：0.9%生理盐水、细菌DNA提取试剂盒、PCR试剂、细菌标志性引物、一般培养基、流感嗜血杆菌选择性培养基和肺炎链球菌选择性培养基等；仪器：保温箱、PCR仪、LuminexTM100悬浮阵列仪等

1.3　方法

1.3.1取样及培养在患儿入院第二天清晨采集患儿呼吸道深部痰液，盛于无菌容器内送检。分别对样本进行细菌培养和筛查菌株(流感嗜血杆菌、肺炎链球菌)的选择性培养，即将样本分别接种于普通培养基、流感嗜血杆菌选择性培养基和肺炎链球菌选择性培养基中，于37℃条件下孵育24 h。

1.3.2聚合酶链反应[7，8]将收集的患儿呼吸道痰液置于DNA提取试剂盒中提取DNA后进行PCR扩增，扩增引物为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等14种细菌的特异性引物。PCR反应过程及条件分别为：变性(95℃、15 min)-退火(94℃、30 s)-延伸(52℃、1 min)，共35个循环。然后采用悬浮阵列方法检测PCR产物的DNA含量。荧光强度中位值(MFI)大于250或值大于阴性结果的平均值加上5倍的标准差者即为阳性，否则为阴性。

1.4　统计学分析

本研究所得数据采用Epi data建立数据库,双人录入，计数资料间比较采取卡方分析。

2结果

2.1　常规细菌培养结果

180个细菌培养基中细菌培养阳性68个，共培养出70株细菌，总阳性率为38.9%。

2.2　聚合酶链反应结果

聚合酶链反应共获得90株细菌，总阳性率为50.0%。

2.3　常规细菌培养与聚合酶链反应比较

对不同菌种而言，聚合酶链反应肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的检出率明显高于常规细菌培养(P<0.05)；以任意一种方法检测出阳性即为阳性标本，检出138株细菌，联合阳性率为76.7%(138/180)；检测阳性率前五位的菌株分别为流感嗜血杆菌(31.1%)、肺炎链球菌(18.3%)、大肠杆菌(7.2%)、鲍曼不动杆菌(6.7%)和金黄色葡萄球菌(6.1%)，见表1。

3讨论

细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入血循环中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染，临床上以高热、寒战、皮疹和关节肌肉疼痛为主要特征，常见于老人、儿童、免疫功能低下等人群，严重者可发展为脓毒血症或败血症[9]。肺部为细菌感染最容易侵入的部位，常可导致患者出现轻重不等的呼吸系统症状，如咳嗽、咳痰、气促、呼吸衰竭等，为儿童时期最常见的疾病[10]。目前，临床上可采用多种方法诊断细菌感染，如培养、分子生物学技术等，但每种方法都存在一定的使用限制。就细菌培养而言，虽然存在较高的特异性，但仍存在以下缺陷：①检测时间较长，对临床用药指示性不强；②对那些要求严格或特别的细菌培养成功率较低；③检测阳性率受前期是否应用抗生素的影响，若应用抗生素，则细菌检测阳性率较低等[11]。随着近年来分子生物学的发展，细菌分析的分子生物学技术崭露头角，其中聚合酶链反应在临床和科研中得到了广泛应用。聚合酶链反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步一个周期，通过周期循环进行，从而使目的DNA得以迅速扩增，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和省时等特点[12]。与常规细菌培养相比，具有准确及时的优势，但每检测一种细菌，需要制备相应的特异性引物，增加了工作的繁杂度，同时，近年来国内外研究发现，聚合酶链反应(PCR)可以从已死亡的菌种扩增出DNA，使得聚合酶链反应(PCR)在检测病原体方面受到了诸多限制[13]。

表1　常规细菌培养与聚合酶链反应联合检出结果

本研究通过对比分析培养与聚合酶链反应对肺炎患儿呼吸道深部痰液细菌病原学的检测情况发现，两种方法检测的细菌主要以肺炎链球菌和流感嗜血杆菌为主，说明儿童肺炎致病菌以这两种细菌为主。另外，聚合酶链反应检测出的细菌种类虽然少于常规细菌培养，但其检测阳性率(50.0%)显著高于常规培养(38.9%)，且聚合酶链反应的肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的检出率明显高于常规细菌培养(P<0.05)，说明聚合酶链反应和常规细菌培养在细菌检测方面有各自的优势。通过将两种方进行联合分析发现，联合检测阳性率为76.7%，明显高于任何一种方法，对不同细菌而言，联合检测流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌检测阳性率最高，更进一步说明儿童肺炎感染的病原菌以此五种细菌为主，在临床不明致病菌的情况下，可采用经验治疗，使用以上五种致病菌的敏感药物。综合以上结果可知，聚合酶链反应和常规细菌培养在肺炎患儿病原菌诊断方面各有优势，联合应用可得到较高的检测阳性率。

参考文献：

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收稿日期：(2013-12-23)

作者简介：谭文涛(1972-)，男，本科学历，主管技师，从事医学检验方面的研究。

文章编号：1007-4287(2015)01-0098-03