E-cadherin在黏附连接的调控机制及肿瘤EMT中的作用研究进展

杨心治，钟 警综述，文格波审校

（南华大学附属第一医院：1.内分泌科；2.临床研究所，湖南衡阳421001）

E-cadherin在黏附连接的调控机制及肿瘤EMT中的作用研究进展

杨心治1，钟 警2综述，文格波1审校

（南华大学附属第一医院：1.内分泌科；2.临床研究所，湖南衡阳421001）

钙黏着糖蛋白类，黏着连接； 综述； 上皮细胞-间质转化

上皮组织中细胞间连接主要由3种基本结构构成并维持稳定：（1）紧密连接；（2）黏附连接；（3）桥粒体[1]。黏附连接的形成主要包括以下几个步骤：（1）钙离子介导的上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）胞外段发生同嗜性结合；（2）连环蛋白（catenin，主要包括β-catenin和p120-catenin）被招募至 E-cadherin的细胞质段；（3）借助catenin，E-cadherin最终连接到肌动蛋白细胞骨架形成结构和功能完整的黏附连接。而由钙离子介导的E-cadherin的嗜同性结合是整个过程中的关键步骤。有学者认为，E-cadherin与骨架蛋白连接的过程极可能由钙粘素/连环蛋白复合物调节，复合物形成后大量汇聚α-catenin，而α-catenin的大量汇聚间接促使E-cadherin与细胞骨架蛋白——肌动蛋白（actin）连接。

细胞间的连接缺失是肿瘤进展的一个关键环节。单个肿瘤细胞脱离原发灶侵入间质后间充质标志物蛋白——波形蛋白（vimentin）、细胞间基质降解蛋白——基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和调控细胞运动的蛋白表达均上调。肿瘤细胞发生的上皮细胞-间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）与胚胎发育和神经嵴细胞移行过程中的间充质转化性质极为相似。肿瘤细胞EMT过程涉及E-cadherin的表达抑制及间质性钙黏素，如神经钙黏素（N-cadherin）和钙黏素-11（cadherin-11）的表达增加[2]。E-cadherin的抑制，是整个EMT的核心环节。目前，已明确E-cadherin的调控涉及转录及转录后水平，而且在EMT过程中，除黏附连接外往往还伴随其他连接复合体的缺失或解体，这一现象的背后究竟是基因抑制的直接效应还是细胞间连接弱化的连锁事件，目前尚无定论。

1 E-cadherin的转录调控和遗传表观沉默

目前，大量研究证实，在EMT过程中转录因子可通过与E-cadherin启动子区域的E-box增强子盒结合在转录水平对E-cadherin进行调控。在众多转录调控因子中，锌指转录因子 1（zinc finger transcription factor 1，Snail1）和Twist被认为是目前主要的调控因子。除组蛋白去乙酰化外，Snail和 Twist还能通过蛋白激酶 B2（protein kinase B2，AKT2）调控苏氨酸残基磷酸化来完成对E-cadherin启动子的抑制[3]。

目前，有研究表明，E-cadherin在上皮源性的肿瘤中的缺失机制可能与肿瘤细胞干细胞转化有关。据文献报道，EMT过程也可诱导普通肿瘤细胞获得肿瘤干细胞的某些表观遗传特性，表示诱导EMT发生的转录因子可能协同表观遗传调控因子参与了调控肿瘤细胞向肿瘤干细胞的转化[4]。近年来的研究成果进一步证明，诱导EMT的转录因子可以与表观遗传调控因子——DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMTs）、polycomb及组蛋白H3赖氨酸9甲基转移酶等相互作用，共同调节肿瘤细胞干细胞化，因而为上皮性肿瘤中E-cadherin的沉默缺失机制提供了更为完整的阐述。

1.1 启动子甲基化 肿瘤细胞中E-cadherin启动子的过甲基化是其表达沉默的常见原因。有研究发现，在正常组织和肿瘤细胞中DNMTs均能抑制E-cadherin的表达。许多信号通路参与了EMT诱导及正常组织成瘤过程中的DNMTs激活过程，如上游激活蛋白——Ras信号通路、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路等。DNMTs能与不同组蛋白重组酶结合，如MMP8、NAD依赖性蛋白脱乙酰酶和常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2——G9a[5]。2011年Espada等[6]发现，DNMT1不仅能与Snail1共同抑制E-cadherin的表达，其本身还参与调控Snail1的表达[6]。随后，有研究进一步表明，Snail1协同G9a和组蛋白甲H3-K9甲基转移酶1（histone H3-K9 methyltransferase 1，Suv39H1）促进过甲基化的发生[7-8]。早在2006年就有研究发现，polycomb能招募DNMT完成DNA的过甲基化，因此，推测Snail1促进启动子甲基化这一事件与组蛋白重组酶（如G9a、Suv39H1和polycomb）导致的DNA甲基化可能存在未被证实的关联性。

1.2 polycomb与EMT诱导转录因子的协同作用 polycomb是构成转录抑制复合物的蛋白之一，其通过染色质重组抑制基因表达。这种polycomb调控的基因表达对胚胎干细胞维持干细胞特性至关重要，而且还同时参与了胚胎发育和肿瘤抑制[9]。通过与polycomb抑制复合物1中的B细胞特异性Moloney鼠白血病病毒插入位点1（B cell specific Moloney murine leukemia virus insertion site-1，Bmi-1）相互作用，Snail1变得更加稳定，并进一步与Zeste增强子同源类似物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）和Suz12（Zeste12）作用抑制E-cadherin的表达[10]。值得一提的是，EZH2通过参与TGF-β1信号通路，间接调控EMT的发生。而Bmi-1在Twist诱导EMT的过程中也具有重要作用。因此，关于EMT诱导转录因子与染色质重组复合物间相互作用的进一步研究，有望在表观遗传学水平为逆转甚至遏制EMT的发生提供新思路。

2 E-cadherin的内吞

黏附连接是一种处于高度动态变化的结构，黏附连接的形成及相关蛋白的重组主要通过内吞和复合体成分循环利用而实现。肿瘤细胞中的黏附连接内吞调控常处于异常状态，而且复合物的循环与降解一旦失衡，将导致E-cadherin的降解和细胞运动能力增加[11]。内吞涉及不同内吞相关蛋白质，目前研究较多的一类蛋白为CD2相关蛋白[12]，而另一类则具有发动蛋白样功能，如Rab蛋白家族、Rap蛋白家族和Rho蛋白GTP酶[13]。

E-cadherin内吞可通过网格蛋白介导的囊泡完成或非网格蛋白途径，如质膜小泡内吞和大胞饮[13]。E-cadherin降解或再循环依赖于不同位点氨基酸残基的磷酸化。Src蛋白酪氨酸激酶的激酶磷酸化酪氨酸占据E-cadherin胞浆段近膜端P120-catenin的结合位点，因此，使黏附连接复合物解体，进而被泛素连接酶——Hakai或鼠双微体基因2降解[14]。

2.1 非网格蛋白介导的内吞 有研究发现，由质膜微囊-1介导的内吞及早期核内体囊泡转运的阻断均可抑制酪氨酸蛋白磷酸酶非受体类型23的表达，质膜微囊-1在表皮生长因子受体信号通路中发挥重要作用，当表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）信号通路激活时质膜微囊-1表达下调，从而导致Snail1表达，促使EMT发生及E-cadherin的缺失。然而，在肿瘤细胞中EGF却诱导由质膜微囊-1介导的E-cadherin降解[15]。脂筏蛋白（Reggie/flotillins）是一种膜性结构支架蛋白，参与调控质膜成分的运输和循环；同时，还在Wnt和Shh信号通路中扮演重要角色[16]。此外，Reggie还参与了E-cadherin的内吞和再循环。Reggie联合朊病毒共同调节E-cadherin的内吞和再循环，并促进其与catenin结合，维持细胞黏附连接[17]。

2.2 网格蛋白介导的内吞 网格蛋白有被小泡在钙离子缺失的条件下可促进E-cadherin的内吞。该内吞途径中的某些连接蛋白，尤其是Numb和有丝分裂原反应磷蛋白同源物2，还参与了EMT中黏附连接的构成调控。Numb的功能复杂繁多，参与调控内吞、细胞迁移、细胞连接形成、信号通路激活及细胞的非对称分裂等过程[18]。尽管目前已有的研究成果多数支持Numb的肿瘤抑制效应，但Numb与肿瘤的关系至今仍未完全阐明。Numb不仅能抑制泛素化标记和P53降解，还能阻止Rac1-GTP的蓄积。一方面Rac1的上调与黏附连接形成和E-cadherin的表达同步，但细胞间连接建立后Rac1却迅速下调；另一方面Rac1-GTP的蓄积与细胞间的连接缺失和板状伪足的形成有关。Numb中的赖氨酸磷酸化结合域与E-cadherin结合后完成胞膜亚定位，从而维持黏附连接的稳定性[19]。有研究发现，Numb与Hakai竞争结合E-cadherin的NVYY序列从而阻断Hakai引起的E-cadherin降解，因此，Numb可能是维持细胞连接和细胞极性的一个重要调控因子。另有研究证明，Numb在细胞膜的表达能促进细胞黏附连接的缺失。Sato等[20]研究发现，Numb可直接与p120-catenin结合，从而导致E-cadherin内吞，但非典型性蛋白激酶C的磷酸化作用能阻止Numb与p120-catenin结合。目前，关于Numb在E-cadherin内吞过程所扮演的角色仍需要大量研究阐明。

Dab-2也是一种内吞相关蛋白，在多数肿瘤中Dab-2的表达常处于缺失状态，因而Dab-2被认为是一种肿瘤抑制因子。在TGF-β1诱导的EMT过程中Dab-2是信号通路激活的关键位点，当AKT2磷酸化核不均一核糖核蛋白E1，解除了Dab-2启动子的抑制后作为TGF-β1的下游靶基因之一，Dab-2的表达上调[21]。近期有研究发现，当Dab-2在表观遗传学水平发生沉默时TGF-β1信号通路由抑瘤效应转为促瘤效应。此外，由经典Smad信号通路Dab-2参与转化生长因子β受体Ⅱ的内吞，并促进TGF-β通路的激活。Dab-2还能下调E-cadherin水平，上调间充质组织标志物的表达，如vimentin[22]，因此，研究人员推测，Dab-2不仅能促进EMT，还参与了调控E-cadherin的表达。有关Dab-2与胚胎发育的研究指出，Dab-2能介导物质定向运输和E-cadherin的极性分布。综合以上发现，Dab-2可能直接影响E-cadherin的运输及降解，但详细机制仍需进一步研究证实。

3 细胞黏附连接与肿瘤进展

当E-cadherin缺失时单个肿瘤细胞通过以下2种方式之一运动迁移：间充质样细胞运动（通过蛋白水解酶使肿瘤组织边缘的单个细胞发生定向运动）或阿米巴运动，后者通常表现为细胞极性缺失的非定向运动。当肿瘤细胞表面表达E-cadherin时肿瘤则以集体迁移的方式完成转移[23]。间充质样运动模式主要与肿瘤局部浸润邻近组织有关，该运动模式难以完成肿瘤的远处转移。值得注意的是，目前有研究发现，在头颈部的鳞状细胞肿瘤中同时观察到肿瘤细胞的单个和集体迁移2种运动方式。因此，在EMT发生后细胞间连接依然存在与否尚有待于进一步观察和研究。

3.1 N-cadherin构成的黏附连接 EMT发生后引起细胞集体迁移，有研究成功发现并报道了乳腺癌细胞中单个迁移和集体迁移2种转移方式的相互转换，并且该转换过程依赖TGF-β1信号通路。实际上，这种细胞运动方式的相互转换往往提示肿瘤细胞可能表达侵袭性更强的细胞表型。除黏附连接外，正常的细胞极性也是促进集体迁移的重要条件。EMT的特征之一就是E-cadherin和N-cadherin的表达转换[2]。“钙黏素转换”并非指N-cadherin取代 E-cadherin，EMT的发生仅上调了 N-cadherin的表达。有研究证实，N-cadherin在乳腺癌细胞中的异位表达促进了癌细胞的转移；同时，用TGF-β1处理小鼠乳腺上皮组织后也观察到乳腺上皮细胞运动能力明显增强。此外，还发现了一个有趣的现象，在EMT过程中N-cadherin的上调虽然增强了细胞运动能力，但与形态学改变无必然联系，而且，N-cadherin的表达往往早于细胞形态学改变。尽管早前有研究指出，N-cadherin的上调可能与Twist调控相关，但具体调控机制仍不明确[24]。虽然，与N-cadherin构成的细胞黏附相比E-cadherin形成的黏附较为薄弱，但在迁移过程中前者仍可稳定维持细胞间联系。在神经嵴细胞的集体定向迁移过程中N-cadherin抑制细胞间形成的突出物，因此，神经嵴细胞能不断移动[25]。N-cadherin介导的黏附连接形成除受Rac1的活性调控外，也与整合素密切相关。在三维环境中N-cadherin是调控细胞集体迁移的重要因素，模拟体内的三维环境促进细胞建立焦点黏附，而在如塑胶面的二维环境中黏附连接形成则可能受影响[26]。EMT发生前会发出微环境改变信号，如细胞外基质的溶解，细胞外基质黏滞度是影响细胞迁移和侵袭的重要因素，而此时外基质发生了改变的三维环境对N-cadherin介导的细胞黏附形成至关重要。虽然，Shih等[27]在2012年报道了N-cadherin胞浆段通过某种途径增强了细胞迁移能力，但N-cadherin介导的黏附连接调控表型转化的上皮细胞迁移的具体机制仍有待于进一步探索。

3.2 细胞外基质在密集型迁移中的作用 细胞的集体迁移受细胞外基质黏滞度的影响和定位调控[28]。Kim等[29]在2011年发现，当细胞外基质黏稠度增加时肿瘤细胞对EGF的信号应答更为灵敏。不仅如此，Leight等[30]还发现，当细胞外基质黏滞度增加时TGF-β1原本的抗增殖效应消失转而表现为促瘤效应。在细胞的集体迁移中细胞外基质黏滞度对细胞黏附强度也具有重要影响。细胞外基质的主要成分由成纤维细胞分泌调控，而成纤维细胞能被肿瘤细胞旁分泌的多种因子激活，当成纤维细胞被激活后随即分泌大量生长因子（如EGF、血管内皮生长因子等）促进肿瘤进展。肿瘤相关成纤维细胞不仅能促进肿瘤细胞侵袭，还能在细胞外基质为肿瘤细胞侵袭提供合适的途径。

4 小 结

细胞黏附连接的调节是一种基于众多信号通路及调控机制参与的精细调控过程。细胞连接的不断形成与解体贯穿于胚胎形成及整个发育过程。参与胚胎形成及发育过程的某些程序（如EMT）在肿瘤形成过程中往往存在异常激活现象。虽然，黏附连接的结构重要性早已阐明，但其各成分在信号通路中的功能直到近年来才开始被逐步发现并证实。E-cadherin的核心功能无疑由多重调控决定，如启动子甲基化、组蛋白甲基化、转录水平抑制、转录后修饰介导的内吞等。随着对上述机制的深入研究，将可能发现新的调控因子，甚至有希望研发新的治疗药物和方案，从而在临床水平重建细胞间黏附连接，抑制甚至逆转EMT。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.11.021

：A

：1009-5519（2015）11-1658-04

2015-01-13）

杨心治（1988-），男，湖南常德人，硕士研究生，主要从事乳腺癌侵袭转移的分子机制研究；E-mail：705462191@qq.com。

文格波（E-mail：wen_gb@hotmail.com）。