碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析

李 莹，柳参奎

（1．东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心，黑龙江哈尔滨150040；2．黑龙江八一农垦大学寒地作物种质改良与栽培重点实验室，黑龙江大庆163319）

碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析

李 莹1，2，柳参奎1*

（1．东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心，黑龙江哈尔滨150040；2．黑龙江八一农垦大学寒地作物种质改良与栽培重点实验室，黑龙江大庆163319）

从碱茅酵母cDNA文库中经过NaCl、Na HCO3筛选，均得到长为1153 bp碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因（Put TPS）片段。通过3′End cDNA amplification方法获得基因缺失的3′序列，该基因全长3358 bp，编码882个氨基酸。氨基酸序列比较结果表明，Put TPS氨基酸序列与水稻、拟南芥、玉米等多种高等植物的TPS蛋白的同源性高达60%～90%。利用Northern blot技术，研究该基因的组织表达模式及NaCl、Na HCO3胁迫处理下基因的表达模式变化；同时对转p YES2-Put TPS基因酵母菌株进行盐、碱、氧化胁迫、渗透胁迫处理，观察其在逆境下的生存表现。结果表明，Put TPS具有组织表达特异性，其中在根和花中表达量最大；NaCl、Na HCO3会诱导Put TPS基因在根和叶中的上调表达；同时重组酵母菌株对盐碱、氧化、渗透胁迫及干旱等逆境的适应能力显著增强。以上研究结果表明，碱茅Put TPS基因与逆境之间具有一定的应答关系，并在植物适应环境逆境过程中起着重要的作用。

碱茅；6-磷酸海藻糖合成酶；基因表达；酵母

海藻糖是由两个葡萄糖分子以ɑ，ɑ-1，1糖苷键连接的非还原性双糖，广泛存在于细菌、真菌、藻类、无脊椎动物和植物中［1］。它是植物在逆境胁迫条件下大量积累的一类物质，对植物抵御干旱、高温、低温、盐、氧化胁迫及营养缺乏等逆境至关重要［2-6］。海藻糖在生物体中的合成途径有5种，分布最广的通路是TPS／TPP途径，包括两个步骤，两个不同的酶。植物体内，途径中，海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）是海藻糖的合成过程中的关键作用酶，即尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖在海藻糖-6-磷酸合成酶的催化作用下合成6-磷酸海藻糖（T6P），然后在海藻糖-6-磷酸酯酶（trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP）作用下生成海藻糖［7-9］。

1998年，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中一些与海藻糖生物合成相关的基因TPS和TPP被发现［10-11］。近期TPS和TPP的同源序列在水稻（Oryza sativa）、烟草（Nicotiana tabacum）、陆地棉（Gossypium hirsutum）及卷叶柏（Selaginella lepidophylla）等多种植物中也被发现［12-16］。植物中的TPS基因都以基因家族的形式存在。已测序的物种中，拟南芥中发现了11个TPS基因，高粱（Sorghum vulgare）中发现了11个TPS基因，水稻中发现了11个TPS基因，蓖麻（Ricinus communis）中发现了13个TPS基因［17-20］。根据是否与酵母TPS1具有同源性，将TPS蛋白分成了两个具有显著区别的类群，只有酵母TPS1属于Class I，同时TPS的活性已经被证实［19，21］。Class II TPS蛋白是否具有TPS活性还未被证实。

由于逆境下海藻糖对生物体的保护作用，目前研究表明，通过转入海藻糖合成相关基因成功地改善了植物对逆境的抵御能力。OsTPS1过表达显著提高了水稻幼苗对低温，高盐，干旱等逆境胁迫的耐受能力［22］。Sl TPS1基因可以有效地恢复酵母突变体tps1Δ对NaCl、Sorbital的敏感性，由此推断Sl TPS1基因在卷柏的抗逆性方面发挥了重要作用［16］。过量表达拟南芥内源TPSI基因的植株耐旱性也得到了提高［23］。因此与海藻糖合成的相关酶在植物抗逆性方面发挥着重要的作用。

碱茅（Puccinellia tenuiflora）是一种禾本科单子叶盐生植物，主要分布在我国的东北松嫩盐碱草甸草原上。与其他盐生植物相比，它在极端盐恶劣的盐碱环境下p H值9～10完成其整个生命周期［24］。它具有一套独特的适应盐碱逆境的生理机制，同时也具有潜在的实用价值。因此，它是一种理想的研究耐盐机制的盐生植物。

本研究利用3′End cDNA amplification方法，克隆得到具有完整ORF的Put TPS基因，并对该基因的组织表达模式以及在盐、碱胁迫处理下的mRNA表达特性进行分析；同时深入分析过表达酵母对盐、碱、渗透、氧化等胁迫的耐受能力。试图探讨盐、碱逆境胁迫下该基因的抗性作用，为深入理解盐生植物抗逆机理积累资料。

1 材料与方法

1．1 植物材料

碱茅植株及种子采自东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心安达野外实验基地。2012年7月分离保存野外生长的碱茅根、茎、叶、花、果等部分组织。同时成熟的种子经20 mmol／L NaCl选种，选出籽粒饱满的种子，5%NaClO3消毒5 min，无菌水洗3～5遍，25℃室温水培养2周的碱茅幼苗为试材，相对湿度60%，光照6000 lx，光照时间为16 h／8 h。分别选取经500 mmol／L NaCl、40 mmol／L Na HCO3处理0，6，12，24，48 h后，分别收集叶部组织（地上部分）、根部组织（地下部分），液氮速冻后保存。并用于后期Northern blot分析。

1．2 基因的克隆与序列分析

碱茅cDNA文库于2008年Ta KaRa公司合成构建于p GCAP10载体上，经过酶切、连接将其构建到改造的酿酒酵母表达载体p AUR101（Ta KaRa，Japan）上。利用LiAc／PEG酵母转化法［25］，将其高效转化到酿酒酵母菌株In VscI（Saccharomyces cerevisiae）中。通过对碱茅酵母文库的耐盐碱性筛选，从中均分离得到一抗性酵母克隆，通用引物PCR产物插入T载体测序得长度为1153 bp，测序后经比对分析发现，该片段为5′端的完整的碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因（Puccinellia tenuiflora trehalose-6-phosphate synthase，Put TPS）的部分序列。通过3′End c DNA amplification方法获得基因缺失的3′序列［26］。所需引物如下：QT：5′-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，QO：5′-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3′，QI：5′-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3′，TPS-RACE1：5′-ATGACCTCTTCGAGGGCTTTCGG-3′，TPSRACE2：5′-ATGACCTCTTCGAGGGCTTTCGG-3′。

经比对拼接后，克隆全长序列。Put TPS基因全长克隆引物如下：TPS-F：5′-TTTCCTCGCCTTGGACTCGC-3′，TPS-R：5′-CTGGATGAGCCGCACGATGT-3′。ORF founder（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／gorf／gorf．html）程序确定其开放读码框。ProtParam（http：／／au．expasy．org／tools／protparam．html）软件计算推导的蛋白质的分子量及理论等电点；利用http：／／www．cbs．dtu．dk／services／TMHMM-2．0／对该基因的跨膜结构分析；利用Blast P（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST／）进行序列同源性搜索；利用Clustal X 1．83软件对具有同源性、不同植物来源的TPS蛋白序列进行多序列比对，并绘制分子进化树。

1．3 m RNA表达特性分析

液氮速冻研磨收集的样品，用TRIzol一步法提取总RNA，以10μg RNA在1．0%的甲醛琼脂糖变性凝胶上电泳，并转移到尼龙膜上。以DIG标记的Put TPS c DNA为探针进行杂交，并利用CDP-Star TM（Roche）来检测Northern杂交信号［27］。

1．4 过表达Put TPS酵母菌株的抗逆性分析

分别取起始OD600约为0．6的p YES2-Put TPS和载体p YES2的10－1，10－2，10－3，10－4和10－5的酵母菌液于1．0和1．2 mol／L NaCl、14和25 mol／L Na HCO3、3．0 mol／L H2O2、1．8 mol／L Sorbital的半乳糖诱导的酵母培养基中，30℃培养3～5 d，调查其生长状态。

2 结果与分析

2．1 Put TPS基因的克隆与序列分析

通过对碱茅酵母文库的耐盐碱性筛选，从中均分离得到一抗性酵母克隆，通用引物PCR产物插入T载体测序得长度为1153 bp的碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因片断，测序后进行BLAST比对，发现具有该基因片段5′端的完整序列。该基因片段的碱基序列与红豆杉（Festuca mairei，JN415683．1）、玉米（Zea mays，GU228588．1 76）的同源性分别为90%，76%。初步确认该基因片段为碱茅TPS基因序列的一部分（图1）。根据这一段序列设计特异性引物TPS-RACE1、TPS-RACE2，分别与3′端通用引物QO、QI配对，扩增分离出长为2500 bp的端片段，测序比对后与中间片段序列一起拼接得到长3400 bp的Put TPS基因的cDNA全长序列，重新克隆基因并测序，Put TPS基因全长3358 bp。序列的ORF finder分析证实该基因的开放阅读框（ORF）长2646 bp，推定编码882个氨基酸，其中5′端非翻译区包括612 bp，3′端非翻译区包括100 bp，3359～3386位为Poly（A）尾（图1）。BLASTP对Put TPS蛋白保守区的预测结果表明该蛋白属于TPS蛋白（图2）。GenBank中选取部分植物的TPS蛋白，经BLASTX分析发现碱茅TPS蛋白与水稻（Oryza sativa Japonica Group，AAN52740．1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，CAB10557．1）、玉米（Zea mays，ADA67991．1）、陆地棉（Gossypium hirsutum，AAV65494．1）、甜瓜（Cucumis melo subsp．melo，ADN34028．1）、红豆杉（Festuca mairei，AEO13239．1）、银杏（Ginkgo biloba，AAX16014．1）、丹参（Salvia miltiorrhiza，AEQ54916．1）、甘蓝（Brassica oleracea，ABD 65165．1）、蓖麻（Ricinus communis，XP-002522255．1）等高等植物的TPS蛋白具有较高同源性，同源性高达60%～90%（图3）。软件Clustalw1．8．1对此种蛋白相近的10个物种的TPS蛋白序列进行聚类分析，结果表明，碱茅中克隆的TPS蛋白与羊草（Leymus chinensis）的TPS蛋白亲缘关系最近，与黄瓜、蓖麻中发现的TPS蛋白亲缘关系较远（图4）。

ProtParam预测该基因编码蛋白质的分子量为100．37 k Da，理论等电点（pI）为9．25，为碱性蛋白。负电荷氨基酸（Asp＋Glu）总数为95，正电荷氨基酸（Arg＋Lys）总数为119。不稳定系数为56．06，为稳定的蛋白质。据TMHMM v．2预测，信号肽预测表明该基因编码的蛋白无信号肽结构。Put TPS编码的蛋白为一种非跨膜蛋白，这一特性与其他植物中发现的TPS蛋白相一致。

2．2 Put TPS基因在碱茅不同组织中的表达

利用Northern blot技术，对Put TPS基因在野外生存碱茅的根、茎、叶、花、种子中的表达模式进行分析。结果表明，Put TPS基因在茎中未见表达，在根、叶、花、种子中均有表达，其中在根和花中表达水平最高，表明Put TPS基因具有组织表达特异性（图5）。

2．3 盐、碱逆境胁迫下Put TPS基因的m RNA水平表达特性

为了研究Put TPS基因与盐、碱胁迫的应答相关性，利用Northern blot技术分析其m RNA在盐、碱胁迫下地上组织和地下组织表达特性的变化（图6）。在NaCl胁迫处理下，该基因在叶部的表达量随着处理时间的延长而增加，当12 h时表达量达到最大。在根部，随着盐处理时间的改变，基因的表达量先降低，但12 h时表达量迅速升高，达到最大，随后逐渐降低。在Na HCO3胁迫处理下，该基因在叶部的表达量在6 h时已达到最大，根部在12 h时表达量达到最大。综上所述，在NaCl、Na HCO3处理下Put TPS基因无论在根部，还是叶部，都主要表现为上调表达。这表明Put-TPS基因有可能参与了碱茅的耐盐、碱应答反应，属于盐、碱逆境胁迫的相关基因。

2．4 p YES2-Put TPS在酵母中的表达及其抗逆性

酵母是单细胞真核生物并与植物有着类似的代谢途径，遗传操作简单易行，是外源蛋白表达的合适宿主，p YES2是半乳糖诱导的过表达载体。因此，本研究利用酵母表达体系开展了转基因酵母对逆境的耐性实验。对含有p YES2-Put TPS和p YES2的酵母菌（阴性对照）逆境处理的抗性检测发现（图7），正常情况下，含p YES2-Put TPS和p YES2的酵母菌在无逆境处理的YPD培养基上生长情况相似；但在1 mol／L NaCl胁迫下转p YES2-Put TPS酵母长势略优于对照菌株；随着NaCl浓度的增加，抗性生长优势力成为明显，当浓度达到1．2 mol／L时，对照菌株无法正常生长，但转p YES2-Put TPS酵母菌株仍可正常生长。说明过表达Put TPS提高了酵母菌株对盐胁迫的耐性存活能力。在碱逆境（14和25 mmol／L Na HCO3）、氧化逆境（3．0 mmol／L H2O2）、渗透胁迫（1．8 mol／L Sorbital）等逆境下，转p YES2-Put TPS酵母菌的长势均明显优于转对照菌株，这些结果均说明Put TPS在酵母中过量表达能够提高其对碱、氧化、渗透逆境的耐性。综上所述，Put TPS基因的过量表达对酵母在环境胁迫中的生长发挥重要作用。

3 讨论

我国因土地盐碱化、荒漠化，造成劣质土地已成为制约区域可持续发展及绿化生态环境的核心因素。在长期进化过程中形成了形形色色的植物，包括有着微妙的适应环境的生长发育调节机制，不同的物种针对相应环境因子的调控作用却有着时空差异的分子基础［28-30］。

分子选育是抗盐碱植物新品种的关键，就是从盐生植物里分离抗盐碱功能基因。碱茅不仅是一种优良的牧草，还是一种宝贵的盐生种质资源，碱茅可在p H 10以上的碱斑地上正常生长发育，目前它被人们称作极端耐盐碱先锋植物，种植碱茅不但对盐碱土壤具有改良作用，同时为相关研究提供了丰富的耐盐碱基因资源。这不仅有助于培育耐盐碱转基因农作物、牧草和花卉，而且还为我国盐碱草甸草原的改良和综合治理提供理论基础，具有重大的经济价值和生态效应。

当植物遭遇干旱、盐碱、低温等逆境时，就会在体内积累各种小分子物质，提高细胞液浓度，降低其渗透势，并保持一定的压力势，来维持细胞的正常膨压。参与渗透调节的物质有很多，大致可分为两大类。一类是由外界进入细胞的无机离子，一类是在细胞内合成的有机物质，如脯氨酸、甜菜碱、甘露醇和海藻糖等。研究表明，海藻糖是一种典型的应激代谢产物；当生物体生长环境良好时，体内不积累海藻糖；而当生物体处于胁迫环境（如饥饿、干燥、高温和高盐碱等）时，体内就会迅速积累海藻糖，海藻糖的积累提高了对生物体内蛋白质、酶与细胞膜等活性物质的保护，而且这些海藻糖会随着不良环境的解除而被降解［30-31］。

植物TPS基因，是海藻糖合成过程中的关键基因，TPS外源基因的导入，即可合成6-磷酸海藻糖。而6-磷酸海藻糖脱磷酸转化为海藻糖，可由细胞内广泛存在的非特异性磷酸酯酶催化完成，所以TPS酶对海藻糖的积累至关重要［10，16］。本研究过表达Put TPS的酵母对盐、碱、氧化及渗透胁迫等多重逆境生长存活能力均有提高，推定过表达Put TPS基因有助于碱茅体内海藻糖合成增加，它的积累提高碱茅对各种逆境胁迫抵御。2003年Jang等［32］在研究转基因水稻Ubi 1：：TPSP（转入TPS和TPP具有双融合功能基因的转基因水稻）时发现，在逆境胁迫下，转Ubi 1：：TPSP基因水稻由于植株体内海藻糖的大量积累，提高了转基因植株对干旱、盐、低温的耐受性。我们的m RNA转录研究表明Put TPS受逆境胁迫诱导，这可能也与逆境胁迫下植株体内海藻糖合成需要大量的酶积累有至关重要的关系。该基因是在极端耐盐碱植物碱茅中分离得到，这也进一步为解释碱茅为何能更好地适应极端恶劣条件的研究奠定了一定的基础。以后研究可以考虑在转基因植物上研究该基因的特性，以期揭示Put TPS基因提高生物抗逆性的机理。这将为深入了解该基因家族的功能提供新的资料，同时也为进一步研究盐生植物的抗盐分子机制鉴定基础，对植物抗逆分子育种工作具有一定的理论指导意义。

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Cloning of a TPS gene and analysis of its function in stress tolerance in Puccinellia tenuiflora

LI Ying1，2，LIU Shenkui1*
1.Alkali Soil Natural Environmental Science Center，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Key Laboratory of Crop Germplasm Improvement and Cultivation in Cold Regions，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China

In this study，a 6-trehalose phosphate synthase gene（TPS）fragment，1153 bp in length，was isolated through NaCl and Na HCO3screening from Puccinellia tenuiflora yeast cDNA library．A 3′-end cDNA amplification technique was used to clone Put TPS．The full-length c DNA is 3358 bp containing an open reading frame（ORF）of 882 amino acids．Multiple alignment analysis based on amino acids of TPS proteins of rice，Arabidopsis，maize，and other higher plants revealed that the amino acid homologies were about 60%to 90%．The tissue expression patterns of P.tenuiflora Put TPS and the expression under NaCl and Na HCO3stress were further investigated by northern blot．Also the recombinant yeast INVScI（p YES2-Put TPS）and control INVScI（p YES2）were subjected to salt，drought，osmotic and oxidative stresses．Put TPS was highly expressed in roots and flowers；in roots and leaves，NaCl and Na HCO3induced up-regulated expression of Put-TPS genes and the recombinant yeast cells showed higher stress resistance than control cells．It was also found that the TPS from alkali grass contributes to salt，drought，osmotic and oxidative resistance．The present study indicated that there was a relationship between Put TPS expression and multiple stresses，and Put TPS may play an important role for P.tenuiflora during adaption to environmental abiotic stress．

Puccinellia tenuiflora；6-trehalose phosphate synthase；gene expression；yeast

10．11686／cyxb20150113 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

李莹，柳参奎．碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析．草业学报，2015，24（1）：99-106．

Li Y，Liu S K．Cloning of a TPS gene and analysis of its function in stress tolerance in Puccinellia tenuiflora．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（1）：99-106．

2013-12-13；改回日期：2014-01-15

黑龙江省寒地作物种质改良与栽培重点实验开放课题资助项目（CGIC201204），教育部创新团队发展计划（IRT13053），黑龙江省自然科学基金项目（C201406），中央高校基本科研业务费专项资金（2572014BA20），863项目（2013AA102701-7）和哈尔滨市自然科学基金（2008RFQXN007）资助。

李莹（1979-），女，黑龙江哈尔滨人，讲师，博士。E-mail：LY7966＠163．com

*通讯作者Corresponding author．E-mail：shenkuiliu＠nefu．edu．cn