基于PCR的几种分子检测技术在布鲁氏菌鉴定中的应用

赵 波综述，崔步云审校

（1．重庆市疾病预防控制中心微生物所 400042；2．中国疾病预防控制中心传染病所，北京102206）

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属的细菌侵入机体引起的人兽共患传染病，常造成牲畜流产和人类多器官的损害。布鲁氏菌属基于宿主特异性分为6个种19个型：马耳他布鲁氏菌（羊型布鲁氏菌）3个型、流产布鲁氏菌（牛型布鲁氏菌）8个型、猪布鲁氏菌5个型和犬种布鲁氏菌、林鼠布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌各1个型［1］，其中，引起人类疾病的主要有羊、牛、猪和狗布鲁菌。布鲁氏病遍布全球，是一个在世界范围内发生的流行性疾病，严重危害流行地区的人们健康和带来巨大的经济损失。全世界160多个国家和地区每年向WHO报告发病例数50万例［2］。中国从2000年起布鲁氏菌病疫情出现上升趋势，并且由原来主要局限在几个重要的牧区，近几年全国几乎所有省（自治区、直辖市）都有病例报道，人间发病率达到1．55／10万［3］。由于布鲁氏菌的病原学和致病特点，大量的活菌操作都被要求在生物安全三级实验室中进行［4］，而关于布鲁氏菌的常规的细菌学鉴定，比如生化、生物学等鉴定都涉及大量活菌的操作，但国内的实际是三级实验室只有极少数实验室装备。因此，近年发展起来的基于聚合酶链反应（PCR）检测与鉴定布鲁氏菌的一些方法引起了大家的重视，与常规的检测方法比较，它需要的菌量少，并且不要求活菌，极大地降低了实验室感染概率，在生物安全二级实验室就可以进行。本文就目前基于PCR检测和鉴定布鲁氏菌的方法的研究和应用综述如下。

1 普通PCR检测技术

普通PCR根据布鲁氏菌的一段特异性核酸序列来设计引物，PCR检测布鲁氏菌最早是由Baily报道的，目前使用得比较多的目标基因有16SrRNA、BCSP31、omp2［4－8］等。选择不同的目标基因对检测的结果敏感性和特异性都有影响［9］，有研究以16SrRNA、BCSP31、omp2作为目标基因进行比较，研究它们在血中做PCR检测布鲁氏菌的灵敏度和特异度差异，得出16SrRNA检测相对灵敏度是最低的，而BCSP31检测是最敏感的［10］。

2 多重PCR检测技术

多重PCR在微生物检测中的应用一般是设计多种病原微生物的特异性引物，在同一PCR反应管进行PCR扩增，可用于同时检测多种病原体或鉴定出是哪一型病原体感染。Probert等［11］对用多重PCR检测布鲁氏菌进行了研究，但只能区分少数的几种布鲁氏菌。García－Yoldi等［12］根据布鲁氏菌不同种的特异性DNA片段设计引物，一共设计了8对引物，多重PCR扩增后按照电泳片段多寡和片段大小不同可以对6种布鲁氏菌都进行区分。刘志国等［13］将多重PCR与荧光PCR技术结合进行研究，建立的方法有灵敏度高、快速、易操作等优点，可用于布鲁氏菌快速鉴定，并同时确定是否为牛种或羊种布鲁氏菌。

3 AMOS－PCR检测技术

布鲁氏菌的AMOS－PCR检测是基于细菌染色体上的重复插入序列IS711的发现建立的，IS711对布鲁氏菌属是特异性的，而且在绝大多数布鲁氏菌种的染色体上至少有一个拷贝序列［14］。有研究者［15－16］根据布鲁氏菌 不同种IS711位 置的差异设计引物，一共设计了5条引物，建立了AMOS－PCR检测布鲁氏菌的方法：即将一个共用引物锚定在这段IS711序列上，其他4条不同的引物分别选在与IS711序列邻近的DNA的特异序列中，通过4个PCR反应的扩增产物的大小和有无来鉴别布鲁氏菌种。这种方法能检测牛布鲁氏菌的生物1、2和4型，羊布鲁氏菌的所有3种生物型，猪布鲁氏菌的生物1型和绵羊布鲁氏菌的所有生物型［15］。后来为了区分布鲁氏菌疫苗株S19和RB51，另外3条引物被增加到上述的AMOSPCR方 法 中［16－17］。AMOS－PCR 能 检 测 大 部 分 布 鲁 氏 菌 到种［15］。

4 细菌基因组重复序列PCR（Rep－PCR）检测技术

研究发现细菌基因组中存在一些特殊的重复序列，常见的包括基因外重复回文系列（repetitive extragenic palindromic，REP）、肠杆菌基因间重复一致序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）和BOX［18－19］，BOX是 DNA序列中一种特异的功能序列，它们在菌株、种、属水平上进化过程有相对保守性，但分布有差异。Rep－PCR通过扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，然后对电泳条带进行分析比较，来揭示基因组间的差异，在细菌演化和流行病学研究中是一种重要的手段［20］。在3种重复序列中，根据BOX重复原件设计引物的Rep－PCR对细菌的区分能力是最高的［21］。

5 多位点可变数目串联重复序列分析技术（MLVA）

基因组的研究发现细菌基因组中分布着一种可变数目串联重复序列（variable－number tandem－repeat，VNTR），VNTR有一定的序列和重复的特点。MLVA的原理即根据研究的需要选取多个VNTR位点设计引物，通过多个PCR扩增这些位点序列，依据电泳结果，必要时也可以通过测序得出VNTR大小、位点的不同以达到菌株分型的目的。Flèche等［22］用筛选了15个微卫星串联重复序列等位标记对已知的236株布鲁氏菌菌株进行了分析，分出来的簇和原本的生物型符合度高。并且他们将15个等位标记分成两组，一组由8个标记组成，能够将布鲁氏菌区分到种；另外一组由7个标记组成，有更高的分型能力，能够对种进行分型。由于MLVA可以数字分析的优势，有研究机构建立了在线的布鲁氏菌MLVA数据库，巴黎第11大学于2007年建立了基于MLVA分型方法的在线数据库（http：／／mlva．u－psud．fr／brucella／），访者可以免费浏览和查询该数据库［23］。在线数据库的应用将极大地方便全球布鲁氏菌分析的交流和比较。

以上几种基于PCR建立的检测和鉴定布鲁氏菌的方法比较，普通PCR只能够将布鲁氏菌鉴定到属；多重PCR能够将布鲁氏菌鉴定到一些种，但多重PCR对DNA提取的纯度和PCR反应体系的条件要求较高，否则将出现假阴性现象［12］；AMOS－PCR能够检测几种重要的布鲁氏菌种，已经能应付绝大多数的疫情处理［15］；Rep－PCR主要应用于布鲁氏菌的分型研究，但由于操作人员和实验室条件的变化对实验结果影响比较大，应用上受到一定的限制；MLVA技术比较容易标准化，结果容易解释，对种和型都能够进行分析，而且易于各实验室的交流比较，显示了很好的发展前景［24］。

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