人乳头瘤病毒疫苗研究进展

高婷婷，王晓红

·专题综述·

人乳头瘤病毒疫苗研究进展

高婷婷，王晓红

宫颈癌的发病率和病死率在女性恶性肿瘤中排第2位，近年来年轻化趋势明显。大量研究表明，高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）感染是宫颈癌发生最主要的危险因素。宫颈癌目前已成为惟一病因明确、可早期预防、早期发现并可能治愈的人类恶性肿瘤。研发疫苗对预防及治疗女性HPV持续性感染，进而预防宫颈癌的发生，提高患者的生存质量，甚至保留年轻患者的生育功能均具有至关重要的作用，有效的HPV疫苗研发具有重大的社会意义和经济学价值。

乳头状瘤病毒科；疫苗；子宫颈肿瘤

2 HPV感染的免疫反应

HPV自然感染后，L1蛋白在宿主细胞大量表达，并有强抗原性，自然感染6～18个月后产生免疫应答。大约70%的感染者可检测到针对L1的抗体，其血清学水平很低，这些抗体虽然可阻断基底膜细胞的初次感染，但对预防继发感染无效[4]。L2蛋白在免疫系统中的作用不明显。但当病毒进入机体上皮细胞基底膜后，L2蛋白暴露并发生构像改变，虽然所占比例小，但第20～38氨基酸序列在各种型别的高危型HPV中高度保守[5]，因此针对这个氨基酸序列的不同抗体，会对更多型别的HPV产生作用。

3 HPV与宫颈癌的关系及其分子机制

目前发现的HPV有170余种，根据其与癌症发生的关系，可分为高危型和低危型，高危型包括16、18、31、33、35、45和58型，与生殖器癌和头颈部恶性肿瘤密切相关。其中，HPV16与54.4%的宫颈癌有关，HPV18与16.5%的宫颈癌有关，在我国HPV58在宫颈癌的发生中占有重要地位[6]。

高危型HPV感染后，其DNA可整合到宿主基因，E2蛋白抑制E6和E7基因表达，E2基因的失活使E6和E7基因大量表达。E6、E7蛋白分别与抑癌蛋白p53、pRb相结合，诱导p53和pRb蛋白失活，抑制p53和pRb对细胞周期的负调控作用，使表达了E6和E7蛋白的黏膜细胞过度增殖，最终发展为肿瘤；其中E7蛋白对细胞周期的恶性转化能力强于E6蛋白。研究表明，宫颈上皮细胞发生癌变的整个过程必须有E6和E7基因的持续表达，E6和E7蛋白对维持癌细胞的恶性表型也起着极其重要的作用。因此认为E6和E7基因的激活是癌变过程的始动因素[7]。

4 HPV疫苗的分类及制备

HPV培养困难，并具有潜在的致癌性，因此HPV减毒活疫苗或死疫苗目前仍不适用于临床。当前研究主要为针对高危型HPV E6和E7特异性靶位构建的治疗性疫苗以及利用L1和L2病毒结构蛋白研究的预防性疫苗。

4.1 治疗性疫苗治疗性疫苗机制较复杂，研究进展相对缓慢，应用较为局限。主要分为载体疫苗、肽类疫苗、蛋白疫苗、DNA疫苗、细胞疫苗和HPV E2疫苗6类。

4.1.1 载体疫苗

4.1.1.1 病毒载体疫苗即将靶抗原编码基因重组到无毒、减毒、弱毒的病毒中制成的疫苗，从而诱导特异性免疫反应，并且其本身可作为免疫佐剂。研究较多的有牛痘病毒疫苗和腺病毒疫苗等。此类疫苗的优点在于有高度免疫原性，但其对免疫抑制的宿主具有危险性，而且由于各种重组载体对目的基因产生的蛋白可进行不同的修饰加工，最终影响其免疫原性。

4.1.1.2 细菌载体疫苗即将编码HPV特异性抗原的DNA片段插入减毒病原菌或共生菌中，并提呈该抗原，以达到治疗目的。常用的细菌载体主要有链球菌、乳酸杆菌、结核杆菌、李斯特菌和伤寒杆菌等。此类疫苗免疫原性高。

4.1.2 肽类疫苗由E6和E7与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）配型的多肽片段制

成的疫苗，能诱导机体产生细胞毒性T细胞反应，其中最主要的代表为E7肽类疫苗。多肽疫苗抗原性弱，一般须辅以佐剂促进机体体液免疫应答，但对细胞免疫无促进作用。目前肽类疫苗已进入Ⅰ及Ⅱ期临床阶段。肽类疫苗临床应用的局限性在于须匹配特定的HLA型别。

4.1.3 蛋白疫苗早期蛋白E6和（或）E7为蛋白质疫苗的抗原部分，E6和E7蛋白免疫原性较弱，表达水平低。E7免疫原性高于E6，具有潜在的致癌性，且野生型E6和E7不易被降解，因此不利于抗原的提呈。E6和E7蛋白常须融合其他蛋白，以提高免疫效果。

4.1.3.1 嵌合蛋白疫苗由HPV晚期蛋白L1或L2的末端与早期蛋白相融合而成，既可刺激机体的体液免疫起到预防作用，又可激发机体的细胞免疫起到治疗作用。但HPV感染者血清中常存在抗晚期蛋白L1和L2的抗体，这些抗体会削减嵌合蛋白疫苗的疗效。

4.1.3.2 融合蛋白疫苗由HPV早期蛋白相互融合或早期蛋白融合其他蛋白构成，从而更好地激发机体的免疫功能，如E6/E7、热休克蛋白（heatshock proteins,Hsp）E7和PD-E7融合蛋白等。其中Nventa公司研发的HspE7最引人注目，HspE7是由HPV16 E7蛋白与牛结核分枝杆菌Hsp65融合而成，利用Hsp可将抗原E7蛋白导入树突状细胞（dendritic cells,DCs）的特性，从而激活E7特异性的细胞免疫。临床结果显示，HspE7对由HPV引起的相关疾病有较好的治疗效果。融合蛋白疫苗无HLA限制，细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）反应无须CD4+T细胞诱导，这对免疫抑制患者具有优势。

4.1.4 DNA疫苗又称基因疫苗，通过基因载体将E6和E7基因导入抗原提呈细胞，并持续表达抗原蛋白，激发机体产生特异性的免疫应答。与肽类疫苗和蛋白疫苗比较，DNA疫苗具有可持续表达抗原，无需佐剂，易于制成多价疫苗，对多型别HPV感染所致的宫颈癌效果更好等优势。但该疫苗免疫原性弱，HPV基因整合后具有潜在危险性，故人体应用的安全性仍有待观察[8]。

4.1.5 细胞疫苗

4.1.5.1 DCs疫苗DCs是最有效的抗原提呈细胞，在肿瘤免疫排斥方面的作用受到越来越多关注，已成为宫颈癌治疗性疫苗研究领域的一个新热点。Nurkkala等[9]发现，将霍乱毒素（cholera toxin, CT）作为佐剂与HPV16E7有机结合冲击DCs，比单独用CT或HPV16E7能更有效地刺激机体的T细胞免疫记忆应答。另一项临床研究发现，HPV16mE7-DC三维结构疫苗较HPV16mE7-DC二维结构疫苗能更有效地诱导T细胞免疫反应，并促进细胞因子IL-12p70及干扰素γ的分泌[10]。然而DCs疫苗制备过程复杂且仅局限于自体使用，规模性生产难以实现。

4.1.5.2 肿瘤细胞疫苗是利用共刺激分子或细胞因子修饰肿瘤细胞以增加免疫原性，免疫后能诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫应答。但该疫苗因须向患者体内导入经修饰的肿瘤细胞，其安全性有待观察。

4.1.6 HPV E2疫苗HPV E2蛋白能抑制E6和E7的转录，并与E1共同调节病毒DNA的复制。Blakaj等[11]研究发现，HPV E2蛋白的氨基酸序列、三维空间结构和静电特征均具有高度保守性，HPV E2疫苗有希望成为宫颈癌广谱疫苗。

4.2 预防性疫苗目前，预防性疫苗已大规模应用于临床，适用于尚未感染HPV甚至尚无性生活经历的年轻人群，可很好地预防相应HPV型别的感染。预防性疫苗分为病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）疫苗和L2共同中和性抗原表位疫苗。

4.2.1 VLPs疫苗VLPs疫苗的制备往往是以VLPs为基础来完成。VLPs是由纯化的L1蛋白装配形成HPV的空衣壳，却无HPV的传染性及潜在致癌性，可诱导机体产生免疫反应，产生针对L1和L2的高水平的中和性抗体，使新进入体内的病毒被抗体中和，病毒与靶细胞粘附的位点封闭，从而使病毒不能穿入细胞内，被机体逐渐清除[12-13]。VLPs疫苗的优点在于保持了天然病毒的空间构象和中和表位，抗原性强，无需佐剂即可诱导高效价中和抗体；而且接种后可在宫颈黏液中检测到针对HPV L1产生的自身抗体IgG，因此强调了在开始性生活之前接种的重要性[2]。其不足之处在于VLPs疫苗存在型特异性。因此，开发具有交叉保护活性的多价疫苗引起了人们的关注。

2006年，美国默克公司生产的四价疫苗（针对HPV6、11、16和18）首先获得美国食品药品监督管理局颁发的营业执照。随后英国葛兰素公司生产的二价疫苗（针对HPV16、18）也在全球许多国家获得营业执照。最新的为美国默克公司生产的九价疫苗（针对HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58）已通过Ⅲ期临床试验，于2014年12月14日经美国食品药品监督管理局批准，目前仅在美国上市。其注射时间为：二价疫苗0、1、6个月，四价疫苗0、2、6个月，九价疫苗0、2、6个月。

4.2.1.1 保护性二价和四价疫苗均能使健康人群机体快速产生高水平的保护性抗体（约注射后7个月达高峰）。在9～15岁的女孩中，保护性抗体水平最高，对相应型别HPV能产生几乎100%的保护性；二价疫苗针对HPV16、18产生的保护性抗体均可维持100%的血清阳性至少8.4年[14]。四价疫苗针对HPV16产生的保护性抗体能维持98.8%的血清阳性至少5年[14]；而对HPV18，从第1次接种后的18个月血清阳性开始持续下降，直到自然感染后水平[15]。但是，这种抗体水平的下降是否与疫苗保护效果相关，还须进一步研究。接种二价疫苗7年后、接种四价疫苗5年后，再次接种第4针时，机体均可快速产生保护性抗体，提示机体具有免疫记忆功能[16]。

对九价疫苗的Ⅲ期临床研究表明，其对HPV6、11、16、18产生的免疫应答跟四价疫苗无差异，并且可以预防由HPV31、33、45、52、58引发的97%的高级别的外阴、阴道及宫颈疾病。九价疫苗应该可以预防90%的宫颈癌，但须进一步观察[17]。

4.2.1.2 交叉保护性二价和四价疫苗都对部分其他型别HPV具有交叉保护性，基于有些HPV亚型的L1蛋白结构相似（如16、31亚型；32、52、58亚型；18、45亚型），四价疫苗对HPV31有交叉保护性，二价疫苗对31、33、45亚型有交叉保护性。对52和58亚型的交叉保护性尚未证实[18-19]。

4.2.1.3 安全性VLPs疫苗无传染性，二价和四价疫苗在注射局部引起的红肿、疼痛以及全身的发热、乏力、恶心、头晕、头疼、肌肉痛的发生率均与对照组无差异；接种四价疫苗与自身免疫性疾病、Ⅰ型糖尿病、静脉血栓栓塞及神经系统疾病无相关性[20]。尚无由此引发的死亡病例，男性使用也是安全的[21]。因此，目前认为这2种疫苗是安全的，人群耐受性良好。

4.2.1.4 减量后的效果HPV疫苗价格高昂，在发展中国家推广困难，因此降低成本提高使用人群覆盖率具有重要意义。2011年在哥斯达黎加对漏种1次二价疫苗和正规接种3次疫苗的女性进行了4.2年的对照研究，结果显示对HPV16、18的预防效果上2组无差异。但是接种2次的人群，对HPV31、33、45无交叉保护性[22]。将接种2次二价疫苗的女性按0、2个月方案和0、6个月方案接种分组，分别与正规接种3次的女性对比，结果显示：0、2个月接种组的免疫反应在24个月后明显减弱；0、6个月接种组3年后与对照组仍无差异[23]。

4.2.1.5 适用人群预防性疫苗可在9岁以上无性生活的女性中接种，考虑到成本效益，各国接种人群的年龄有差异，大多数国家为11～12岁的女孩接种[24]。在美国，主要为13～18岁的女性接种[25]。考虑到接种后可防止男性生殖器癌及疣的发病[26]，澳大利亚和美国同时对男孩进行接种[27-29]。然而，建立的数学模型显示：增加女孩的接种人数相较对男孩进行接种，对HPV感染的预防更有效[26,30]。

4.2.2 L2共同中和性抗原表位疫苗在高危型HPV L2蛋白中的20～38氨基酸序列高度保守，针对这段氨基酸序列的抗体，会对更多型别的HPV产生作用[2]。但是，L2疫苗的主要问题在于免疫原性很弱，产生中和抗体滴度很低[3]。近年来发展的基因工程抗体技术——噬菌体抗体库技术可以让L2的抗原决定簇暴露，诱导机体相应的免疫反应，产生高亲和力的抗体，滴度比L1抗体稍低。目前已有相关的小鼠实验[31-32]。L2疫苗有望成为高危型HPV的广谱预防性疫苗。

5 展望

目前，HPV预防性疫苗已取得了巨大的成功，治疗性疫苗的研究进展相对缓慢。但是，HPV疫苗在发展中国家的应用尚面临诸如价格昂贵、转运及储存困难，以及新疫苗的接种政策、融资机制、人群的依从性差等问题。不久的将来，疫苗有望成为防治HPV感染，预防宫颈癌的首选。

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（2015-02-09收稿 2015-03-12修回）

（责任编委 貌盼勇 本文编辑 陈玉琪）

Research progress of human papillomavirus vaccines

GAO Ting-ting,WANG Xiao-hong*
Department of Obstetrics and Gynecology,Tangdu Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi710038,China
*Corresponding author,E-mail:wangxh-99919@163.com

Currently,the morbidity and mortality of cervical cancer rank the second place among gynecological malignancy worldwide,and show the tendency of occurring in younger patients in recent years.Previous studies have demonstrated that high-risk typesofhuman papillomavirus(HPV)are themostsignificant risk factors associated with the incidence of cervical cancer.Cervical cancer seems to be the only humanmalignancy which has clear cause,and can be prevented and detected early,and even be cured.The developmentof vaccinesare important for prevention and treatmentof persistentHPV infection,prevention of cervical cancer,improvementof quality of life in patients,and even preserving fertility in younger patients.So,the effective developmentof HPV vaccines is of greatsocialand economic significance.

papillomaviridae;vaccines;uterine cervicalneoplasms

R373.9

A

1007-8134(2015)02-0115-05

1 HPV的结构和特性

710038西安，第四军医大学唐都医院妇产科（高婷婷、王晓红）

王晓红，E-mail:wangxh-99919@163.com守，特异性强；L2编码的衣壳蛋白较少，但变异多。URR为非编码区，又称长控区，主要控制ER和LR的转录及病毒颗粒合成。在上述10种蛋白中，L2、E1和E4均不能使感染者产生天然免疫，而L1在感染后的数周或数年有50%～100%的感染者产生保护性抗体，这也是HPV疫苗制备的基础之一；E2在早期感染中将会产生细胞免疫，有助于感染损伤的修复；E7与癌前病变期的迟发型超敏反应有关；基于HPV的致病机制和天然的免疫原性，HPV疫苗研究聚焦于L1、E2、E5、E6和E7[3]。

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，多发于发展中国家，目前宫颈癌的发病率和病死率呈年轻化的趋势[1]。研究表明，99%以上的宫颈癌组织中发现高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染，1999年HPV作为宫颈癌发生中最关键的因素在全球范围内达成共识[2]。针对HPV的深入研究推动了HPV疫苗的研究和开发，开创了宫颈癌防治的新方向。

HPV是一种嗜上皮性的双链闭环小分子DNA病毒，基因约8 kb，具有高度宿主特异性和传染性，只感染皮肤和黏膜。HPV只有1条DNA链可作为转录模板，大致可分为早期转录区（early gene region, ER）、晚期转录区（lategene region,LR）和上游调节区（upstream regulatory region,URR）3个功能区。ER编码E1～E8 8种早期蛋白，参与调节病毒DNA的复制、转录、翻译及细胞转化等功能。LR编码病毒的主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2，L1高度保