泛素蛋白连接酶E3介导的EMT在肿瘤浸润与转移中的作用

综述

【摘要】上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition EMT)是指上皮性质的细胞出现了间质细胞的特性，具有运动及转移能力。泛素-蛋白酶体系统是降解体内蛋白质的主要途径，在维持机体内蛋白质动态平衡方面起主要作用。本文就EMT的相关信号通路以及泛素蛋白连接酶E3介导EMT在促进肿瘤浸润与转移进行综述。

【文章编号】1005-3697(2015) 05-0732-07

【文献标志码】A

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.05.42

基金项目:国家自然科学基金(81172496)

收稿日期: 2014-11-04

作者简介:谢少利(1987－)，男，四川广安人，硕士，主要从事乳腺癌的基础与临床研究。

通讯作者:邓世山，E-mail: xsl675086087@ yeah.net

网络出版时间: 2015-10-26 17∶14

网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20151026.1714.084.html

The role of EMT mediated by ubiquitin protein ligase E3 in invasion and metastasis of cancer

XIE Shao-li 1，XING Tian-yong 1，DENG Shi-shan 2

(1.Department of Thyroid and Breast Surgery，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College; 2.Department of Human Anatomy，North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Epithelial mesenchymal transition (EMT) refers that the epithelial cells appears characteristics of mesenchymal cells，with movement and metastasis.The ubiquitin proteasome system(UPS) regulates degree of proteins to maintain the dynamic balance of proteins.In this paper，the EMT signaling pathways and its role mediated by ubiquitin protein ligase E3 and resulting in invasion and metastasis were reviewed.

【Key words】Epithelial mesenchymal transformation; Ubiquitin proteasome system; Ubiquitin protein ligase E3

蛋白质是生命功能的执行者。人体内的蛋白质降解主要通过两种途径，即溶酶体途径和泛素-蛋白酶体系统途径(ubiquitin proteasome system，UPS)，后者具有高度选择性。UPS由泛素(UB)、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、泛素延长酶E4、去泛素化酶DUB(DUB)和26S的蛋白酶体组成。到目前为止，发现只有少数几种E1酶，约30种的E2酶，约600种E3酶 ［1］。在UPS中由于E3酶独特的结构和功能域，从而决定了其介导的靶蛋白降解反应的高度选择性与特异性。

1　泛素蛋白连接酶E3

到目前为止，发现的E3酶按其结构和生化机制的相似性分为四类:第一类是具有HECT(Homolog of E6-AP C-Terminus)结构域的E3连接酶，如UBE3A，它主要是通过形成硫酯键将活化的泛素与底物进行结合。第二类是具有RING(Really Interesting New Gene)结构域的E3酶，具有这种结构的E3酶既能单独也能与其他E3酶协同作用于底物，具有RING结构域的E3酶能够通过E2-E3结合物进行自动泛素化 ［1］。第三类是具有PHD结构域和U-box-type结构域的E3酶如UFD2a、CHIP，虽然他们因为具有不同的基础结构被另外分类，但是他们与具有RING结构域的酶有相同的酶活性中心，主要认为他们是降解没有折叠或者被错误折叠的蛋白质。另外一类就是最近发现的一些不典型的E3酶，如A20，其OUT结构域的氨基末端能够使某些某些泛素化的蛋白去泛素化，同时其锌指结构域的羧基端有就有E3酶的作用 ［2］。E3酶广泛参与细胞内的代谢过程，比如细胞增殖、细胞周期调控、细胞的凋亡。这些酶的调节异常与多种疾病有关，如神经系统疾病与恶性肿瘤 ［3］。

2　上皮-间质转化

人们普遍认为细胞达到终末分化状态后可以维持其细胞分化状态不变并发挥其特定的生物学功能。终末分化状态的上皮细胞间的紧密连接具有屏障保护功能。近年来研究表明处于终末分化状态的上皮细胞还可以通过某种行为而改变它们的表型，向间质细胞发展、分化，并最终成为成熟的间质细胞，从而参与多种病理生理过程，这种行为称为上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。Greenburg等 ［4］于1982年在其实验中发现晶状体上皮细胞在胶原凝胶中可以形成伪足，暂时失去极性，转变为间质细胞样形态，同时获得远处迁移能力，从而提出了EMT。EMT最大的特征是上皮细胞层表面标志物E-cadherin表达降低，N-cadherin、vimentin蛋白增加 ［5］。大量研究发现，EMT广泛存在于机体生理病理过程中，如胚胎发育、组织再生 ［6］、组织器官慢性纤维化(如肝肾的纤维化) ［7］以及肿瘤的浸润和转移 ［8］，其中EMT与肿瘤侵润与转移的关系倍受关注。

EMT可分为三种亚型 ［9］:与胚胎植入、胚胎形成和器官发育相关的EMT能衍生出不同的细胞类型，这些细胞都具有间质细胞的表型特征，这类EMT即称为“1型EMT”;与创伤后炎症愈合、组织再生和器官纤维化相关的EMT称为“2型EMT”;与肿瘤浸润与转移相关的EMT称为“3型EMT”。EMT的机制目前并不完全清楚，其可能与多种复杂的信号通路有关。

3　与EMT有关的信号通路

3.1　Wnt/β-catenin信号通路

β-catenin是一种转录因子，其含量受Wnt信号通路的调节。当Wnt与细胞表面相应的跨膜受体Frizzled蛋白结合后，激活细胞内的Dvl蛋白，Dvl蛋白能够抑制蛋白激酶GSK3-β，从而阻止β-catenin磷酸化;未磷酸化的β-catenin在细胞质内积聚，其可顺利进入细胞核，与T细胞因子4(TCF4)、淋巴细胞增强因子(LEF)相互作用，形成转录复合物，从而激活众多导致EMT的基因转录 ［10］，如Snail2(也称之为Slug)和Twist。相反，当缺乏Wnt的时候，GSK3-β保持其活性，并且与CKIα(Casein Kinase Iα)一起磷酸化β-catenin，再之后与APC(Adenomatous Polyposis Coli)和一种可以使β-catenin泛素化的链接酶β-TrCP形成复合体引起β-catenin通过泛素蛋白酶体途径降解。此外，进入细胞核的β-catenin还可以抑制E-cadherin的转录，从而降低细胞间的紧密链接，从而诱导EMT发生 ［11］。

3.2　TGF-β/Smads通路

转录生长因子(Transforming Growth Factor β，TGF-β)在生命活动中具有双重功能，对正常上皮细胞和早期肿瘤细胞具有抑制作用，但当肿瘤细胞对这种抑制作用出现抵抗时，TGF-β反而会促进肿瘤细胞的生长、浸润和转移 ［12］。TGF-β是以一种隐藏的形式存在于细胞外基质，当TGF-β与丝苏氨酸激酶受体TβRI和TβRII结合后，使Smad2和Smad3蛋白磷酸化，从而激活这两种蛋白。活化后的Smad2和Smad3与Smad4形成三聚体一起进入细胞核，形成复合物，共同扮演着转录因子的角色 ［13］。与此同时，TβRI能够更进一步通过Ras路径激活ShcA、Sos1、Grb2 ［14］。TGF-β、TβRI、TβRII、Smads也是通过泛素蛋白酶体途径被降解，参与降解的E3酶主要是HECT家族中Nedd4亚家族 ［15］。TGF-β肿瘤抑制与促进功能是细胞内连续的过程，被Smads复合物控制。TGF-β还可以诱导Snail、Slug、ZEB1、ZEB2、FOXC2、FOXQ1，结果使E-cadherin转录和翻译受到抑制，从而促进EMT ［16］。

3.3　Notch/Nicd通路

在哺乳动物中，Notch可与多种配体Deltalike1、3、4和Jagged-1、Jagged-2结合，结合后，Notch能被ADAM(A Disintegrin and Metalloprotease)分离释放出具有核定位信号的胞质区ICN(intracellulardomain of Notch)，ICN通过泛素依赖的内吞作用进入细胞核与CLS结合，调控基因表达 ［17］。Notch与Jagged2结合后，能够激活Akt、上调Slug，抑制E-cadherin，这就促成了EMT，大大提高肿瘤细胞在低氧环境中的存活率 ［18］。此外，Notch通路也能够调节TGF2 ［19］。

3.4　Hedgehog信号通路

在哺乳动物中有三种类型的Hedgehog(HH)，分别是Sonic Hedgehog (SHH)、Indian Hedgehog (IHH)、Desert Hedgehogs(DHH)。HH与相应的受体结合后，解除Smo(Smoothened)蛋白的抑制状态。Smo与在Hedgehog信号通路中的作用相当于Wat通路中的Del蛋白，即可以通过GSK3、CKI、PKA抑制转录因子Gli的磷酸化，使其进入细胞核，开始相关基因的转录; HH还可以通过泛素蛋白酶体途径促进SuFu(Suppressor of Fused)的降解，SuFu是一种Gli的抑制物 ［20］。脊椎动物存在3种Gli转录因子(Gli1、Gli2、Gli3)，他们的结构与功能有所不同，这3种Gli蛋白均含有高度保守的DNA结合区，后者构成锌指结构域。在没有Hedgehog信号时，Smo处于抑制状态，Gli被磷酸化，再被之后的泛素蛋白酶体途径降解水解为75ku的片段，进入细胞核，抑制Hedgehog信号相关基因表达，参与降解的酶主要有β-TrCP以及后来发现的Nedd4s家族中的Itch也参与降解Gli ［21］。Isohata等 ［22］发现，在食管癌中Gli通过激活ZEB2的转录来促进EMT。Kwon等 ［23］也证实Gli1可通过上调MMP-11(Matrix Metalloproteinase 11)促进EMT相关的肿瘤浸润。此外，在肺癌细胞系中，通过RNA干扰沉默HH，随之TGF-β蛋白也大大减少，因此认为HH与TGF-β共同促进EMT ［24］。

3.5　RTK信号通路

受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)信号通路包括很多受体:如表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptors，EGFRs)、血小板演化生长因子受体(Platelet Derived Growth Factor Receptor，PDGFR)、肝细胞生长因子受体(the Hepatocyte Growth Factor Receptor，HGFR)、神经生长因子受体(Nerve Growth Factor Receptor，NGFR)、纤维母细胞纤维母细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor Receptor)等。这些受体与相应配体结合又主要激活两个下游通路即Ras/Raf/MEK/ERK通路和PI3K/Akt通路。活化的AKT可通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及肿瘤细胞的转移 ［25］。mTOR蛋白也能被AKT激活，使细胞生长加快，蛋白产量增加和促进EMT ［26］。

4　E3　酶与EMT

4.1　β-TrCP

β-TrCP(β-transducin repeat-containing protein) 是F-box型E3酶中的一员，其编码基因位于人类染色体10q24-q25。β-TrCP在EMT多种信号通路中起作用。在Wnt通路中，在缺乏Wnt刺激时，GSK3-β保持其活性，并且与CKIα(Casein Kinase Iα)一起磷酸化β-catenin，再之后与APC(Adenomatous Polyposis Coli)以及一种可以使β-catenin泛素化的连接酶β-TrCP形成复合体导致β-catenin通过泛素蛋白酶体途径降解。同时，在Wnt信号通路的参与下，β-TrCP也降解原癌基因H-Ras的转录产物，共同调控着EMT ［27］。在Hedgehog通路中，在没有Hedgehog信号时，Smo处于抑制状态，Gli被磷酸化，再被之后的泛素蛋白酶体途径降解水解为75ku的片段，进入细胞核，抑制Hedgehog信号相关基因表达 ［28］。

4.2　Skp 2

Skp2(S-phase kinase-associated protein2)是F-box型E3酶中的一员，其编码基因定位于人类染色体的5pl3，由436个氨基酸残基构成，其分子质量为45kD，因此也被称之为p45蛋白。Skp2可参与调节周期素依赖性蛋白激酶抑制剂(Cyclin Dependent kinase inhibitors) p27、p21在肿瘤进展中发挥作用 ［29］。在TGF-β信号中，主要降解无功能的Smad4，从而促进TGF-β在EMT中的作用。同时，TGF-β通路也促进Skp2在细胞核的定位，以致Skp2被另一种E3酶APC/C(Anaphase Promoting Complex/Cyclosome)识别降解 ［30］。

4.3　Fbw7

FBW7(F-box and WD repeat domain-containing 7)是F-box蛋白家族的成员之一，它属于SCF型E3泛素连接酶，由SKP1、CUL1、RBX1和F-box四部分构成，FBW7以蛋白复合物的形式发挥生物学功能 ［31］。FBW7参与调节细胞周期进程、细胞增殖、细胞分化、DNA损伤应答、细胞凋亡、细胞癌变等多种细胞生物学过程 ［32］。如上所述，Notch信号通路参与调节细胞分化，促进EMT。FBW7在对Notch的调控中不仅能够降解其上游的调控因子Presenilin，还能降解下游的C-myc转录因子，占据整个信号通路的支配地位，贯穿该信号通路的始终 ［33］。

4.4　Cullin 7

Cullin 7，也称为CUL7，人类的Cullin 7由1698个氨基酸组成，包含有两个不同功能的结构域，一个是一个DOC结构域，另一个是CPH结构域。Cullin 7与Skp1、ROC1和Fbw8组成复合物，形成一个单元，与特异底物结合，行使E3酶的功能 ［34］。已经证实Cullin 7与两种细胞蛋白cyclin D1 ［35］和胰岛素受体底物IRS-1(Insulin receptor substrate 1) ［36］的蛋白酶体降解有关。Cyclin D1是一个重要的G1到S期细胞周期进程调控因子，受翻译后调节。IRS-1是胰岛素和胰岛样生长因子1(IGF-1)下游信号通路的一个关键元件。其被相应受体激活后，募集SH2适配器蛋白激活下游Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/ akt信号通路，这些信号通路在EMT中，扮演着重要角色。此外，cullin7、Fbxw8复合物还通过干扰P53功能参与EMT的调节 ［37］。

4.5　NEDD4s

NEDD4s家族是研究最早，也是研究最多的一类E3酶，到目前为止，有9个成员。它包含HECT、C2和WW三个功能结构域，位于N端C2结构域起亚细胞定位作用的，位于中间的WW结构域起识别底物蛋白作用，位于C端有HECT结构起与泛素结合的作用。在TGF-β信号通路中，Smads被NEDD4s家族的E3酶特异识别、降解，同时Smurf1 (Smad ubiquitin regulatory factor 1)，Smurf2与TGF-β受体结合，使该通路中断，未被刺激的Smads不能被磷酸化，反而被泛素化降解 ［15］。除了TGF-β信号通路，NEDD4s还调节参与EMT的其他蛋白因子，如VEGFR2 ［38］(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2)、IGF-1R ［39］，神经生长因子受体TrkA ［40］。PI3K/Akt信号通路的抑制剂PTEN也是被NEDD4s家族成员识别降解 ［41］。

4.6　UBE3A

UBE3A又称E6AP(E6 associated protein)，属于含有HECT结构的E3泛素蛋白连接酶家族成员，编码人类UBE3A蛋白的基因位于染色体15q11-13。AnnexinA2为膜联蛋白Annexin家族中的一员，与肿瘤的发生、浸润与转移相关 ［42］。有相关报道，AnnexinA2通过参与Rho/Rock通路，导致细胞间黏附降低从而形成EMT，使肿瘤细胞发生远处转移 ［43］。同时，Deng等在乳腺癌组织和癌旁组织差异蛋白质组学研究实验中发现，在乳腺癌组织中UBE3A和AnnexinA2均高表达 ［44］，其可能原因是在乳腺癌中，大量的UBE3A形成，降解能够抑制Rho/Rock通路的相关蛋白，促使AnnexinA2大量积聚，导致EMT的发生。

5　EMT与肿瘤浸润和转移

恶性肿瘤的浸润与转移是引起癌症患者死亡最主要的原因，包括原发部位增殖、肿瘤细胞侵袭基底膜基质及正常细胞、通过循环系统进入其他器官继续增殖，形成与原发肿瘤性质相同的肿瘤形成的过程。在这个过程中，肿瘤细胞间粘附能力减弱和肿瘤细胞运动能力增强是转移发生的基础 ［45］，近年来，随着多EMT研究的深入，在多种肿瘤细胞中发现存在EMT现象。

5.1　肝癌

Hashiguchi等 ［46］通过免疫组化的方法分析ZEB-1、E-cadherin在肝癌中的表达，得ZEB-1高表达同时伴随E-cadherin的低表达，患者的预后较差，ZEB-1的表达促进肝癌细胞发生EMT。Liu等研究发现诱导14-3-3ε蛋白的表达能够使Zeb-1、Snail的表达增高，从而促进EMT;与通过干扰阻低14-3-3ε组相比，肝癌细胞的浸润转移能力明显增强 ［47］。

5.2　膀胱癌

Bryan和Tselepis根据当前关于EMT在膀胱癌相关研究在其文章中总结出，在正常的膀胱上皮其基底层表达P-cadherin，而在膀胱癌细胞中P-cadherin的表达上调，同时伴随N-cadherin的表达，这两种蛋白在细胞间的紧密连接起着重要的作用。同时当P-cadherin、N-cadherin表达时，与细胞间紧密连接相关的E-cadhern减少，从而导致EMT发生，促进膀胱癌的浸润与转移 ［48］。如上所述，Snail、Slug参与EMT的信号通路，Yu等人发现Slug、Twist的表达上调，同时伴随着Snail、E-cadhern表达下调，增加了肿瘤细胞浸润和转移能力，患者的预后也相应较差 ［49］。Kenney等在其体外实验中Zeb-1被诱导上调或者被RNA干扰阻低表达后，膀胱癌细胞系的浸润和转移能力相应增强或者减弱，并且也有E-cadhern的减少，从而认为Zeb-1参与EMT是膀胱癌的一个重要预后因素 ［50］。

5.3　结肠癌

在研究结肠癌的过程时，有学者发现在肿瘤和正常组织交界处的肿瘤细胞可表达EMT相关基因，因此此处细胞更易发生EMT，从而失去上皮细胞表型、细胞间粘附能力减弱，导致肿瘤的侵袭和转移能力增强 ［51］。Li等人在其实验中发现在在无血清的培养基中，结肠癌细胞系HCT-116中Zeb1高表达(Zeb1是一种导致EMT的转录因子)。且在其后续实验中通过RNA干扰阻低Zeb1的表达，肿瘤细胞的浸润转移能力增强 ［52］。

5.4　肺癌

Maitah等在研究非小细胞肺癌时，将A549细胞系暴露在TGF-β1中，诱导A549发生EMT时发现Hedgehog的一种亚型-SHH在基因水平和蛋白水均高表达，且对照相比其浸润能力明显增强，同时;之后通过RNA干扰阻低SHH，抑制Hedgehog信号通路，A549中EMT有逆转趋势，其浸润能力相应减弱 ［24］。

5.5　乳腺癌

EMT与肿瘤的侵袭转移密切相关，在乳腺癌也不例外。Michael等通过降低EMT的表面标志物E-cadherin的表达，乳腺癌细胞的浸润与转移能力增强。在其后续的研究发现，主要是通过TGF-β的调节导致EMT ［53］。在诱导耐三苯氧胺的乳腺癌MCF-7细胞系中发现此细胞能获得EMT表型，同时其浸润转移能力增强 ［54］。临床资料也显示乳腺癌新辅助化疗后，残存的细胞也表现为间质细胞的特点 ［55］。

总之，EMT是恶性肿瘤浸润转移的重要机制之一，但是EMT中不同信号转导通路和分子之间的相互作用极为复杂，还需要更深入地研究EMT的分子生物学机制。相信随着分子生物学研究相关技术的逐步进步，越来越多的作用因素将会被联系起来。UPS作为体内降解蛋白质的主要途径，维持体内蛋白质的平衡具有重要作用。研究UPS与EMT的发生机制的相关性及其调节因素在肿瘤生长、浸润、转移中的作用，以及如何阻断这一机制的发生，在肿瘤的诊断治疗中有重要意义，势必成为肿瘤研究的新热点，对EMT这个复杂过程的进一步阐明可能给寻找治疗肿瘤转移的方法提供新的思路。