抗结核重组BCG疫苗研究进展

【摘要】结核病仍是严重威胁人类健康的传染病之一，卡介苗(mycobacterium bovis bacillus calmette-guérin，BCG)是唯一被批准用于结核病预防的疫苗，但近年来的研究发现其免疫保护效果极不稳定，构建重组BCG成为目前新型抗结核疫苗研究的重要方向之一。本文概括性地介绍了抗结核重组BCG疫苗研究的必要性、抗结核重组BCG的研究策略与研究进展以及存在的问题和未来展望。

【文章编号】1005-3697(2015) 05-0595-05

【文献标志码】A

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.05.05

基金项目:教育部重点项目(205138)

收稿日期: 2015－07－20

作者简介:杨爱琼(1970－)，女，四川渠县人，主管药师，主要从事分子基因药物学研究。

通讯作者:谢勇恩，E-mail: cbyxye0369@163.com

网络出版时间: 2015-10-26 17∶14

网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20151026.1714.010.html

Research progress of recombinant BCG vaccines against Mycobacterium tuberculosis

YANG Ai-qiong 1，XIE Yong-en 2

(1.Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College; 2.Institute of Molecular Biology，North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Tuberculosis is still a severe infectious disease threatening human health.Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the only vaccine approved for prevention of tuberculosis.However，it was found that BCG had very unstable or variable protective effect against tuberculosis in recent years.Constructing recombinant BCG is one of the most promising areas in developing new anti-tuberculosis vaccine.This article summarizes the necessity，strategies，progress，problems and future prospect of the recombinant BCG study.

【Key words】Tubercolosis vaccine; Recombinant Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin; Immunogenicity; Protective immunity

卡介苗(mycobacterium bovis bacillus calmetteguérin，BCG)用于结核病的预防已有近一百年的历史了，在全世界范围内已经接种超过40亿人口 ［1］。近年来，多项研究发现BCG对不同地区人群的免疫保护效果差异较大，其有效性为0%～80%不等，尤其是BCG对于成人结核病的预防作用极差，研制新型抗结核疫苗等成为目前的研究热点，如蛋白质亚单位疫苗、DNA疫苗和重组BCG疫苗等 ［2－3］，本文就抗结核重组BCG疫苗的研究进展作一综述。

1　抗结核重组BCG疫苗研究的必要性

虽然BCG在全世界范围内已经广泛应用于结核病的预防接种，但并未十分有效地阻止结核病的蔓延，相反，近年来结核病的发病率和死亡率均呈现上升趋势，使人们不得不对BCG的预防作用进行重新评估。研究发现新生儿或婴幼儿接种卡介苗后，可以有效预防儿童时期结核病的发生，但不能预防成年后结核病的发生 ［4－5］。在一项历时15年的随机双盲对照研究中，超过10 000人被随机分为BCG免疫接种组和安慰剂对照组，免疫接种后定期筛查结核杆菌感染者及结核病患者，结果发现卡介苗接种对预防成人结核病几乎无保护作用 ［6］。因此，急需研制可预防成人结核病的新型抗结核疫苗，近年来，国内外学者对蛋白质亚单位疫苗、DNA疫苗、重组痘苗病毒疫苗、重组耻垢分支杆菌疫苗等在结核病预防中的作用进行了大量研究，但就其安全性、有效性等方面的综合数据分析来看，这些疫苗短时间内仍难以取代BCG ［7－8］。因而，在研制新型抗结核疫方面，对BCG进行重组和改造以增强其免疫原性和免疫保护性，可能是更加切合实际和行之有效的研究途径 ［9］。对于那些免疫功能缺陷的患者，如HIV患者，BCG的免疫接种可能导致播散性结核病的发生，也需对BCG进行进一步减毒和改造 ［10］。

2　抗结核重组BCG的研究策略及其研究进展

2.1　过量表达结核杆菌免疫优势抗原的重组BCG

研究发现，结核杆菌某些抗原分子不仅在其菌体蛋白或分泌性蛋白中含量较高，而且其免疫原性较强，在感染结核杆菌的患者体内，针对这些抗原分子的抗体含量亦较高，因而被认为是结核杆菌的免疫优势抗原，如Ag85A、Ag85B、Ag85C和HspX蛋白等，构建重组BCG过量表达其免疫优势抗原可能增强BCG的免疫活性。在这方面，目前研究得最多的是Ag85B，在感染结核杆菌的患者体内抗Ag85B抗体检出率较高 ［11］，Ag85B含有多个T淋巴细胞识别表位，能诱导机体产生较强的Th1型细胞免疫应答 ［12］。Horwitz等 ［13］构建了过表达Ag85B的重组BCG(rBCG-85B)，将103CFU的rBCG-85B给豚鼠皮下单次注射进行免疫接种，免疫9周后用致病性结核杆菌进行攻击实验，随后的检测发现接受rBCG-85B免疫的豚鼠抵抗结核杆菌攻击的免疫保护作用明显强于接受亲代BCG免疫的豚鼠。另一个研究得较多的免疫优势抗原是Ag85A，Ag85A抗原分子中也存在多个CD4 +和CD8 +T淋巴细胞的特异性识别表位 ［14－15］，Sugawara等 ［16］构建了过表达Ag85A的重组BCG(rBCG-85A)，给恒河猴进行免疫接种，然后用致病性结核杆菌进行攻击实验，发现接受rBCG-85A免疫的动物其肺组织病理损害明显轻于接受亲代BCG免疫的动物。Jain等 ［17］则对过量表达结核杆菌Ag85C的重组BCG (rBCG-85C)进行了研究，豚鼠接种rBCG-85C或亲代BCG第6周后，用结核杆菌H37Rv株进行攻击实验，攻击10周后取动物的脾、肝和肺组织，观察其病变程度，并对脾和肺组织匀浆进行结核杆菌培养，计数其菌落，发现接种rBCG-85C的豚鼠其脾、肝和肺组织的病变程度显著轻于接种亲代BCG的豚鼠，接种rBCG-85C的豚鼠其脾和肺组织匀浆培养后生长出的结核杆菌菌落数也显著低于接种亲代BCG的豚鼠。在随后的研究中，Wang等 ［18］不仅构建了可过表达单个抗原蛋白的重组BCG，即前述的rBCG-85A和rBCG-85B，还构建了可同时过表达Ag85A和Ag85B的重组BCG(rBCG-AB)，将其免疫C57BL/6小鼠后检测其免疫原性和免疫保护性，发现3株重组BCG的免疫原性和免疫保护性均强于亲代BCG，而rBCGAB的免疫原性和免疫保护性明显强于过表达单个免疫优势抗原的重组BCG。

2.2　表达RD区抗原的重组BCG

比较基因组学研究发现，BCG与致病性结核分枝杆菌在基因组水平存在明显差异，目前共发现16个差异区域(region of difference，RD)，分别命名为RD1-RD16 ［19］。BCG传代培养过程中由于遗传变异等因素导致这些区域在BCG基因组缺失。进一步研究发现，这些区域含有多个与结核杆菌致病性和免疫性相关的重要抗原基因，如RD1区可编码ESAT-6、CFP-10及PPE68等结核杆菌免疫优势抗原。构建可表达RD区抗原的重组BCG可能增强BCG的免疫活性。Bao等 ［20］构建了可分泌表达ESAT-6抗原蛋白的重组BCG以及可将ESAT-6锚定于细胞膜表达的重组BCG，并以小鼠作为接种对象，对这两株BCG的毒力、免疫原性和免疫保护性进行了研究，结果发现两株重组BCG的毒力与亲代BCG相比较没有明显差别，免疫接种后8～12周内两株重组BCG比亲代BCG可产生更高水平的抗体和更强的细胞免疫应答，但其免疫保护效应与亲代BCG相比较没有明显差异。Deng等 ［21－22］构建了可表达Ag85A的重组BCG(rBCG-85A)、可表达ESAT-6的重组BCG(rBCG-E6)以及可表达Ag85A-ESAT-6融合蛋白的重组BCG (rBCG-AE)，比较分析这三株重组BCG及亲代BCG在动物体内的免疫原性及免疫保护性，发现rBCG-AE免疫小鼠所产生的特异性抗体应答和Th1型细胞免疫应答均明显强于rBCG-85A、rBCG-E6以及亲代BCG，但rBCG-AE并不能增强小鼠抵抗致病性结核杆菌攻击的能力，甚至其免疫保护作用还不及其亲代BCG。Ma等 ［23］将两个拷贝的esat-6基因插入ag85a基因的ACCⅠ酶切位点形成融合基因，将此融合基因分别克隆入含突变的furA启动子的分支杆菌差异表达载体pMFA11和pMFA41，获得rBCG186和rBCG486两株重组BCG，Western blotting检测发现rBCG486融合蛋白Ag856A2的表达量比rBCG186高出3倍以上，这两株重组BCG与亲代BCG分别免疫C57BL/6小鼠，免疫8周后每组取6只小鼠处死后分离小鼠脾淋巴细胞，检测其抗原特异性IFN-γ的诱导表达情况，其余免疫小鼠用致病性结核杆菌H37Rv进行攻击实验，结果发现rBCG486免疫小鼠脾淋巴细胞IFN-γ的诱导表达量明显高于rBCG186和亲代BCG免疫小鼠，rBCG486和rBCG186免疫小鼠抵抗致病性结核杆菌攻击的能力均明显强于亲代BCG，但两株重组BCG的免疫保护效应无显著差异。Sali等 ［24］将结核杆菌PE-PGRS33蛋白的PE功能区与结核杆菌RD2区抗原MPT64融合表达构建重组BCG，由于PE-PGRS33蛋白是结核杆菌的一个膜蛋白，其PE功能区具有膜锚定功能，可引导MPT64蛋白定位于卡介苗膜表面表达，该重组BCG接种小鼠后检测其免疫保护性，发现其免疫保护效应明显强于亲代BCG，该研究还构建了可在胞浆中表达MPT64蛋白的重组BCG，发现其诱导特异性细胞免疫应答的能力明显弱于可将MPT64膜锚定表达的重组BCG，该研究同时还发现MPT64蛋白的表达量也能影响其免疫效果，必须使用含强启动子(如分支杆菌hsp60启动子)的表达载体让MPT64蛋白在重组BCG过量表达才能产生更有效的免疫应答。

2.3　表达某些细胞因子的重组BCG

某些细胞因子具有重要的免疫调节功能，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)能增强抗原递呈细胞共刺激分子B7的表达及MHC II类抗原分子的表达，促进抗原递呈细胞前体细胞的成熟，增强其抗原递呈能力。白细胞介素12(IL-12)能促进Th1型淋巴细胞的分化增殖和功能的提高，诱导CTL和NK细胞的细胞毒活性。白细胞介素15(IL-15)能促进自然杀伤细胞、T细胞及某些内皮细胞的发育，并且是记忆性T细胞的生长因子和调节因子，而且能诱导细胞毒性T细胞的活化和增殖。将这些细胞因子与结核杆菌免疫优势抗原共表达或融合表达构建重组BCG，有可能增强BCG的免疫活性 ［25－26］。Ryan等 ［27］构建了可分泌表达小鼠GMCSF的重组BCG(rBCG-GM-CSF)，其所表达的GMCSF能刺激小鼠骨髓源性前体细胞分化为成熟的抗原递呈细胞，用这种rBCG-GM-CSF免疫小鼠7到14天后，其引流淋巴结具有CD11c +MHCⅡ +和CD11c -CD11b +F480 +表面标志的成熟抗原递呈细胞数目及这些抗原递呈细胞表达协同刺激分子的数目均显著高于亲代BCG免疫的小鼠，免疫攻击实验发现rBCG-GM-CSF免疫小鼠抵抗结核杆菌攻击的能力显著强于亲代BCG免疫的小鼠。Yang等 ［28］将GM-CSF与ESAT-6融合表达构建重组BCG(rBCG-GE)，同时构建了可表达GM-CSF的重组BCG (rBCG-GM-CSF)和可表达ESAT-6的重组BCG(rBCG-E6)，将其分别免疫BALB/c小鼠后检测其免疫原性，比较分析发现rBCG-GE能诱导小鼠产生更高水平的抗体和更强的Th1型细胞免疫应答，但该研究未进一步检测rBCG-GE的免疫保护效应。Tang等 ［29］构建了可表达结核杆菌Ag85B与IL-15融合蛋白的重组BCG(rBCG-85B-IL15)，动物免疫接种后发现，rBCG-85B-IL15诱导CD4 +和CD8 +记忆性T细胞增殖和产生γ-干扰素的能力明显强于rBCG-85B，而且rBCG-85B-IL15诱导CD8 +记忆性T细胞的能力明显强于其对CD4 +记忆性T细胞的诱导作用，因而可能产生更强和更持久的抗结核免疫保护作用。Deng等 ［30］将人白细胞介素IL-12的p70亚单位与结核杆菌Ag85A抗原融合表达构建重组BCG(rBCG-IA)，免疫接种BALB/c小鼠，发现接种后第2-8周rBCG-IA免疫组所产生的特异性抗体、脾淋巴细胞增殖率及产生IFN-γ的能力均明显高于亲代BCG。但rBCG-IA免疫小鼠抵抗结核杆菌攻击的能力与亲代BCG相比较无显著差异。

2.4　营养缺陷型重组BCG

Grode等 ［31］采用电穿孔法将携带李斯特菌溶菌素基因的大肠杆菌分支杆菌穿梭表达载体pMV306hyg-Hly导入BCG尿素酶C缺陷株，构建了携带李斯特菌溶解素而自身尿素酶C缺乏的重组BCG (rBCG ΔureC: : hly)，将rBCG ΔureC: : hly及亲代BCG分别免疫小鼠后，用致病性结核杆菌进行攻击实验，发现rBCG ΔureC: : hly免疫小鼠抵抗结核杆菌攻击的能力比亲代BCG更强，其免疫保护作用也比亲代BCG更持久。进一步研究发现rBCGΔureC: hly被抗原递呈细胞摄取后，由于尿素酶C缺乏可以显著降低所形成的吞噬溶酶体的pH值，使李斯特菌溶菌素充分显示其膜穿孔活性，大量分支杆菌抗原肽及溶酶体水解酶漏出到宿主细胞胞浆中，促进抗原递呈细胞凋亡，进而促进抗原的交叉递呈(cross-priming)，使更多的分支杆菌抗原肽与MHC-Ⅰ类分子结合而递呈给CD8 +T细胞，从而诱导更强的抗结核细胞免疫应答。Gengenbacher等 ［32］进一步敲除rBCG ΔureC: : hly的维生素B 6合成酶基因pdx1 (Rv2606c)构建BCG营养缺陷株BCG ΔureC: : hlyΔ pdx1，在外源性添加维生素B6的情况下，BCG ΔureC: : hlyΔ pdx1免疫小鼠后短期内可产生与亲代BCG相似的免疫保护效应，但长时间观察发现其免疫保护作用不及BCG ΔureC: : hlyΔ pdx1及亲代BCG，但重症联合免疫缺陷小鼠接种BCGΔureC: : hlyΔ pdx1后，其存活时间较接种rBCG ΔureC: : hly及亲代BCG者明显延长，因而这种营养缺陷型重组BCG可能更适合于免疫功能低下的患者(如HIV患者)的免疫接种。

3　问题与展望

综上所述，由于BCG免疫保护效应的不稳定性，构建重组BCG增强其免疫效应成为近年来新型结核病疫苗研究的热点之一。虽然研究发现某些重组BCG相对于亲代BCG具有明显的优越性，但也还存在一些亟待解决的问题: (1)构建重组BCG时使用质粒载体可能导致机体对抗生素耐药的问题; (2)引入细胞子可能干扰机体的正常免疫功能; (3)目前机体抗结核免疫应答以及结核杆菌免疫逃逸的分子机制尚未完全阐明，因而，难以选择最佳的抗原组合使重组BCG达到最佳的免疫效果。这些问题仍有待于进一步深入研究加以解决。随着分子免疫学学科的不断发展，研究方法和研究手段将越来越先进，相信在不久的将来，抗结核重组BCG疫苗研究一定会取得新的突破。