间充质干细胞归巢与胃癌发生关系探讨

李海文，赵自明，任金玲，林钟宇，赵金媛，赖秋华，曾进浩,潘华峰

(1.广州中医药大学，广东 广州 510405；2.广东省中医药工程技术研究院，广东 广州 510095)

综 述

间充质干细胞归巢与胃癌发生关系探讨

李海文1，赵自明2，任金玲1，林钟宇1，赵金媛1，赖秋华1，曾进浩1,潘华峰1

(1.广州中医药大学，广东 广州 510405；2.广东省中医药工程技术研究院，广东 广州 510095)

间充质干细胞；归巢；胃癌

干细胞是一类具有无限的自我更新能力的细胞，多向分化和自我更新是干细胞的2个基本特征。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞具有增殖分化为所在器官组织中细胞的潜能。近年来，随着对肿瘤起源和发病机制的认识加深，提出了肿瘤干细胞理论。越来越多的研究表明胃癌可能是一种干细胞疾病，胃癌细胞中可能存在胃癌干细胞(GCSC)。但由于缺乏特异性表面标志物，目前还没有理想的技术分离出人GCSC，只能通过形态学与功能上的特点分离鉴别GCSC。现将GCSC的存在、起源、归巢与胃癌的关系探讨如下。

1 肿瘤干细胞

自从19世纪病理学家首次提出肿瘤干细胞以来[1]，目前已经从乳腺癌[2]、脑肿瘤[3]、前列腺癌[4]、黑色素瘤[5]、肝癌[6]、胰腺癌[7-8]、结肠癌[9-10]、头颈部肿瘤[11]、多发性骨髓瘤[12]、胰腺癌[13]、卵巢癌等肿瘤中分离出了肿瘤干细胞。目前一致认为肿瘤干细胞有自我更新和形成肿瘤组织的能力。

2 GCSC

2.1 GCSC存在的依据 越来越多的证据证明了GCSC的存在。Takaishi等[14]用细胞表面标记物CD44+表型细胞移植入NOD/SCID鼠胃和皮下能形成肿瘤组织，CD44-表型的细胞植入NOD/SCID鼠体内未形成肿瘤，这显示了CD44+细胞具有自我更新和分化成不同组织的能力。Jianming等[15]将胃癌细胞株MKN-45进行体外克隆实验，得到了球形细胞克隆，这些球形细胞具有自我更新、增殖、药物抗性、致瘤性等肿瘤干细胞样特征，同时表达胃癌细胞的基因和蛋白质。表明在一些胃癌细胞株中确实存在一些细胞具有肿瘤干细胞的特性。Cao等[16]从胃癌组织中分离到一些间充质样干细胞，它们的形态、表面抗原、基因表达和分化潜能都和骨髓分离出来的间充质细胞相似，但与胃癌细胞不同，这些间充质样干细胞可以促进血管及细胞外基质的形成，从而促进肿瘤的生长，提示了间充质样干细胞可能成为胃癌治疗中的新靶点。这些研究提示间充质样干细胞是胃癌的成分，也证明GCSC的客观存在。

2.2 GCSC 正常情况下胃黏膜上皮每2～7 d更新1次，这个过程是由胃成体干细胞分化完成的，胃成体干细胞能分化形成各种上皮细胞，并能产生完整的腺体。因胃黏膜上皮细胞具有快速更新的特点，故分化成熟的上皮细胞没有足够长的生存期累积突变，只有寿命较长的干细胞才有可能不断积累突变。目前对GCSC的起源尚无定论，部分医家认为肿瘤干细胞起源于胃成体干细胞。胃干细胞是有自我更新和复制能力的原始细胞，主要位于胃颈、峡部的生发中心，可分化为不同类型的上皮细胞，属于成体干细胞[17-18]。正常情况下，胃成体干细胞处于微环境中[19]，通过不断增殖分化来维持组织的稳定。Kirchner等[20]认为胃癌起源于胃干细胞，这些细胞从胚胎发育期保持在一个未分化状态，或者起源于成熟细胞的未分化，成熟细胞的去分化可以使细胞回到具有增殖和更新潜能的胚胎细胞类型。研究发现弥漫型胃癌起源于胃黏膜增殖区，而这一区域恰恰被认为是胃干细胞停留的位置，因此从肿瘤发生的解剖部位也支持弥漫型胃癌起源于胃干细胞结论。综合上述观点，笔者总结胃癌的发生模式可能为:胃干细胞遭受多个基因突变的打击，其增殖与分化机制发生异常，导致上皮异型增生，最后形成癌组织。

越来越多的研究证明，肿瘤干细胞起源于骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)。Houghton等[21]先将小鼠骨髓细胞辐射杀死，再将标记的骨髓细胞移植到小鼠体内，用幽门螺杆菌感染小鼠，感染后 6～9 个月小鼠黏膜层发生萎缩，上皮细胞发生转化。同时，骨髓细胞在黏膜层出现，并且随时间的延长来源于骨髓的细胞增多，在感染后12～18个月胃上皮细胞肿瘤几乎全部来源于骨髓细胞。Jonathan等[22]认为MSC被上皮损伤引发的炎症激活，并促使其归巢，参与胃黏膜修复，当MSC对组织修复失败时，就可能转化为初始癌细胞。同时不同类型幽门螺杆菌感染可以通过肿瘤坏死因子激活NF-κB信号通路，从而引起MSC的迁移。该研究为幽门螺杆菌感染引起的MSC迁移提供了证据。以上资料表明GCSC很可能来源于间充质干细胞。

3 间充质干细胞归巢与胃癌

GCSC起源于MSC的学说已被大多数人认可，但是MSC穿过血管选择性地到达靶器官并定植(即归巢)的机制仍在探索。研究表明，干细胞向损伤或缺血等组织迁移的归巢行为与白细胞趋向炎性组织的机制十分相似[1]。一些分子已经被证实参与了MSC的归巢。

3.1 趋化因子与MSC的迁移 MSC从血液循环中迁移到组织中，这可能与MSC在损伤等情况下对一些分子信号应答的上调有关。趋化因子是一类趋化细胞定向移动的小分子糖蛋白，发挥生物活性时必须结合特异性G蛋白耦联受体。在炎症反应中，炎性细胞的聚集需要多级的黏附，信号传导之间也需要协调配合，趋化因子家族及其受体，一直被认为是介导白细胞在正常或炎症条件下的迁移和体内重分配的重要因子。现在许多研究表明它们也是操控MSC动员和迁移的重要因子。Jones等[23]将人类早期妊娠的胎儿血液间充质干细胞移植到成骨不全症的小鼠模型中，导致小鼠的骨折率明显下降，他们发现MSC迁移到骨和骨髓依赖于CXCR4-SDF1(SDF1是基质衍生因子)。Wang等[24]发现，骨髓干细胞的定向迁移对SDF1的浓度具依赖性；若在实验前加入CXCR4的阻断剂AMD3100，则骨髓源性干细胞的迁移能力与对照组相比明显降低，这个研究说明SDF1通过结合它的受体CXCR4趋化MSC的迁移作用。除了CXCR4，人MSC上还在能表达具有趋化功能的CCR1、CCR4、CCR7、CCR9、CXCR5和CXCR6等趋化因子。这提示MSC能像表达大量趋化因子受体的白细胞一样具备迁移归巢的能力。

3.2 黏附分子与MSC迁移 黏附因子是指介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合的一类分子，大都为糖蛋白。黏附分子以配体受体相对应的形式发挥作用，参与细胞的信号转导与活化、细胞伸展移动、肿瘤转移等一系列过程。Ruster等[25]为了探索移植间充质干细胞溢出的初始步骤，用人MSC注入小鼠耳朵的静脉内，发现MSC能沿着血管壁滚动，且这种滚动在遗传性血小板选择蛋白(P-selectin)不足的小鼠会明显减弱。此外，用P-selectin抗体中和后，MSC在剪下的其动脉内皮细胞上的滚动明显减弱。表明P-selectin和反配体与MSC外渗有关。各种整合素分子被认为表达于MSC[1]，其他黏附因子如血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、VCAM-3、VCAM-3、ALCAM、endoglin、CD105也有报道。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激大鼠MSC也能增加其VCAM-1的表达，而且用抗VCAM-1抗体处理静态培养作用于CMVE后，其黏附能力消失，但用抗ICAM-1的封闭抗体无效。Steingen等[26]将MSC融入内皮单层细胞中，其黏附、整合、迁移所需要时间取决于内皮细胞的表型，在心肌静脉中迁移最快。同时，三维系统显示，MSC通过细胞突起渗入内皮和周围组织。这种迁移需要交互的VCAM-1和很晚抗原4(VLA- 4)，也通过阻断实验触发了integrin β1聚集。

3.3 MSC与跨内皮游出 MSC具有从血液循环中迁移，从而跨内皮细胞游出并进入组织的能力。Teo等[27]发现MSC依赖VCAM-1和G蛋白耦联受体，首先黏附通过肿瘤坏死因子激活的内皮细胞，这个过程持续数小时。另外，他们发现MSC 2种新的迁移方式，一种是内皮细胞间的转运，另一种是MSC直接穿过单个内皮细胞。这个过程表现出起泡，与转移瘤和胚胎干细胞的转移方式相似。该研究表明MSC和内皮细胞的低捆绑性有利于MSC的起泡。Matsushita等[28]开发了一个体外培养系统以研究大鼠大脑毛细血管内皮细胞和MSC迁移的关系，采取静脉注射密度为1.5×104cells/cm2的MSC，24 h后MSC在内皮细胞下或者薄膜下被发现，表明MSC已经通过大脑毛细血管内皮细胞。延时成像显示，MSC瞬间在微血管内皮细胞形成细胞缝隙并穿过内皮细胞。Schmidt等[29]在小鼠离体心脏上灌注MSC来观察体内实验的效果。在灌注2 h后离体心脏的内皮间的紧密连接结构被破坏，MSC已经接触到了内皮细胞，这说明MSC的跨内皮游出可能与内皮细胞间的紧密连接结构的破坏有关。这些只是对MSC跨内皮游出机制的一些推测，具体的机制还有待深入研究。

4 GCSC表面特异性标志物

现阶段胃癌干细胞缺乏特异性标志物，分离纯化出人类GCSC的技术尚不是十分理想，因此，利用肿瘤细胞表面的特异性标志物来分离纯化人类GCSC也就成为目前研究的热点和方向。近年来，流式细胞分选术和磁式分选术是利用细胞表面标志物来分选特定细胞最常用的技术。虽然目前为止，还没有比较统一的表面特异性标志物，但是对GCSC表面特异性标志物的研究还是取得了可喜的成就。CD44是研究比较多的细胞表面标志物，又称Hermes抗原、H-CAM(human cellular adhesive p85 molecule)、淋巴细胞归巢受体和细胞外基质Ⅲ型受体(ECM R-Ⅲ)等，是一组细胞表面的糖蛋白，介导细胞与细胞、细胞与基质间相互作用。Takaishi等[14]以CD44 作为特异性表面标志物，发现CD44+胃癌细胞在体外无血清培养基中成球形集落生长，注射到SCID小鼠体内数周后形成肿瘤；而用shRNA 敲除了CD44 基因的CD44-胃癌细胞在体外培养中形成的球形集落大大减少，接种于SCID小鼠体内形成的肿瘤也小得多，而且不管在体外还是体内，CD44-细胞种群成瘤能力都明显减弱。进一步的研究发现在这些分子中CD44分子的表达与癌细胞的致瘤性是一致的。Tie等[30]发现，CD44+CD54+胃癌细胞在体外无血清培养基中形成球形集落，注射到免疫缺陷小鼠体内能形成肿瘤，分化形成胃上皮细胞，不管在体内还是在体外都能高度不断自我更新。而CD44+CD54-、CD44-CD54+和CD44-CD54-细胞种群在培养基上不能形成球形集落，注射到免疫缺陷小鼠体内也不能形成肿瘤。CD133是一个含有5个跨膜区域的单链糖蛋白，主要在干细胞、祖细胞和肿瘤干细胞表达，一直被作为分离和鉴定这些细胞的标志。当细胞分化时，它在细胞表面的表达快速下调。越来越多的研究表明，CD133已经广泛用作鉴别结肠癌、肺癌，脑肿瘤和胰腺癌等癌症的标志物[31-34]。唐毕锋等[35]研究发现CD133 mRNA在正常胃黏膜中也有表达，但是在胃癌原发组织中的表达率为100%，并且相对灰度值明显高于癌旁组织，提示CD133可以作为GCSC表面标志物进行深入研究。然而Rocco等[36]的研究发现原发性人胃癌纯化的CD133+和CD133+/CD44+细胞未能在免疫缺陷小鼠和裸鼠体内形成肿瘤，提示CD133可能不是GCSC的特异性标志物。巢蛋白作为胃腺癌干细胞表面标志物是近年来才提出来的。Sadhna等[37]利用免疫组化技术研究发现胃腺癌干细胞中巢蛋白的表达，提示巢蛋白可能是GCSC的另一个表面标志物。总之，GCSC标志物在胃癌发生发展、侵袭转移、耐药性和预后中起着重要作用，一旦找出理想的特异性GCSC表面标志物，将为胃癌早期诊断和有效治疗开辟新的领域。

5 展 望

GCSC作为新的切入点治疗胃癌，其机制仍有待阐明。越来越多的研究证明GCSC来源于MSC，研究者也从MSC在内皮细胞的黏附、整合、迁移等方面进行了机制阐述，通过对这些基因和信号分子的研究，可以明确MSC归巢与胃癌发病关系的切入点，这可能将从根本上提高胃癌的疗效。但归巢时间不明确，确定归巢时间有助于精确对MSC进行调控。目前的肿瘤治疗方法，无论是化疗还是放疗，都是靶向针对肿瘤组织中的肿瘤细胞，并不是针对肿瘤干细胞，这也从一方面解释了治疗失败的原因，因此推断癌症唯一有效的治疗方法即靶向消除肿瘤干细胞。对MSC归巢的深入研究可以在胃癌发生前清除GCSC，这将对肿瘤干细胞靶向治疗提供新策略。

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潘华峰，E-mail：gzphf@126.com

国家自然科学基金资助项目(81473620)；广东省联合培养研究生示范基地人才培养项目(2013JDXM20)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.10.043

R735.2

A

1008-8849(2015)10-1133-04

2014-10-08