Notch信号通路调控内皮细胞增殖与分化的研究现状

罗甜 综述，谭钢 审校

（南华大学第一临床学院，湖南衡阳421001）

Notch信号通路调控内皮细胞增殖与分化的研究现状

罗甜 综述，谭钢 审校

（南华大学第一临床学院，湖南衡阳421001）

内皮细胞；血管内皮生长因子类；Notch信号通路；综述

Notch是一类进化上高度保守的跨膜蛋白家族，广泛表达于各类细胞表面。Notch基因由Thomas Hunt Morgan首次在果蝇中发现并命名。Notch信号通路通过经典途径或其他途径被激活后，引发一系列分子反应，调控细胞的表型、增殖、分化、迁移及凋亡。目前对Notch的研究涉及神经干细胞、造血干细胞、心瓣膜及血管的形成、胚胎发育、肿瘤发生发展及人工组织工程等多个领域。血管组织工程及角膜组织工程是近期人工组织工程研究的热点。相应的血管内皮及角膜内皮细胞系的构建是上述人工组织工程的关键。现就Notch信号通路调控内皮细胞增殖与分化的研究现状作一综述。

1 Notch信号通路

Notch信号传导途径在进化上是十分保守的，对胚胎发育至关重要。其通过短距离通讯调节细胞命运和干细胞的维持。此外，Notch信号途径参与了许多生理和病理过程。异常Notch信号可以在不同的器官，如乳腺、肠和皮肤诱发肿瘤[1]。

在高等脊椎动物中，Notch的同系物已被鉴定，包括Notch1到Notch4（通常称为Notch受体）。Notch1和Notch2彼此具有最高的同源性，而Notch3的和Notch4较Notch1和Notch2具有略微发散结构。Notch的胞内结构域是已知的转录激活因子，常常被称为活化的Notch。Notch受体对应多种配体（Jagged1/Serrate1、Jagged2/ Serrate2、Delta1、Delta3和Delta4）。Delta1、Jagged1和Jagged2已被证实为Notch1、Notch2和Notch3的配体。普遍认为Jagged和Delta作为跨膜蛋白与表达于相邻细胞表面的Notch受体相互作用[2]。

Notch信号传导途径调控多种细胞活动，包括分化、增殖、凋亡、细胞间黏附和迁移，甚至包括介导细胞间的相互作用。典型Notch途径涉及细胞表面的Notch分子，其依次扮演一个受体和转录因子的角色。与相邻细胞的配体结合启动Notch受体一系列的蛋白水解反应，Notch受体经配体依赖性细胞外裂解，释放胞外结构域，留下一端连于细胞内表面的胞内结构域。随后胞内结构域由γ-secretase裂解，引起活化的Notch（Notch ICD或NICD）释放进入细胞质。该过程可被γ-secretase抑制剂γ-分泌酶抑制剂（DAPT）阻断。NICD转位到细胞核，在那里与DNA结合蛋白CBF1（在哺乳动物中也被称为RBPJk）交互作用并结合成的活化态的复合物，从而抑制或共激活各种谱系特异性基因的表达。该NICD/CBF1激活复合物中包括共激活因子Mastermind（在哺乳动物中被称为MAML），是Notch靶基因转录的起始物[3]。Notch靶基因包括HES家族基因和HES相关基因Hesr1和Hesr2（也称为Hey/Herp基因），其编码的bHLH转录因子有促进祖细胞存活和抑制分化的作用[4]。在大多数生理和病理情况下，Notch信号的表达结果取决于量化参数。Notch靶基因的激活水平与信号的“强度”和相邻细胞表面Notch受体-配体相互作用的动态变化密切相关。最新的基因和基因组的方法显示的Notch信号可以通过大量基因的衰减和上述典型途径被集成在一个复杂的基因电路中集中输出[5]。Notch靶基因可被其他非典型的Notch信号传导途径调节，例如NICD，CSL，甚至Notch受体本身，具体而言，即血管内皮生长因子-A（VEGFA）/VEGFR-2途径和Notch靶基因的独立活化[6]。Notch信号通路既可以通过简单的典型途径激活，又有能力通过与其他途径的结合激活。因此，Notch信号通路中靶基因的表达及该途径中的其他步骤都应该被详细研究以便全面地认识Notch依赖性机制。

2 Notch信号通路调控血管生成及内皮细胞

血管主要由血管内皮细胞、血管平滑肌细胞（SMC）及细胞外基质组成。血管的生成是指未分化的前体细胞在原位分化为内皮细胞，再组装成无功能的血管迷路，原始血管网生长和重塑形成有正确结构血管网的过程[7]。

VEGF或VEGF-A强烈地促进血管生成，是血管发育不可或缺的元素。其结合了酪氨酸激酶受体VEGFR-1（Flt1）和VEGFR-2（Flk1），后者是在内皮细胞中产生血管内皮生长因子信号的初级受体[8-9]。VEGFR-1结合的VEGF-A的能力比VEGFR-2强，且VEGFR-1酪氨酸激酶很容易被激活，这使得活化的VEGFR-1以及其可溶形式sVEGFR-1成为内皮细胞VEGF的诱导剂，调节VEGFR-2的活化和血管芽的形成[10]。VEGFR-2全程参与了内皮细胞中VEGF-A的反应，即调节内皮细胞的生理状态：增殖、迁移和血管形成。

VEGFR-3是VEGFR家族的第3个成员，仅在淋巴血管网形成过程中表达。该受体可被VEGF-C和VEGF-D激活。VEGF-C还可结合VEGFR-2使其蛋白水解，导致VEGFR-2/VEGFR-3的异二聚体的形成和活化[11-12]。但VEGF-C对VEGFR-3的亲和力最强。VEGFR-3也调节血管生成，其缺失的小鼠原始血管丛形成过程中会产生严重的动脉-静脉重塑缺陷导致小鼠死亡[13]。VEGF-C/ VEGFR-3被公认在淋巴血管网形成中的作用。VEGFC双等位基因缺失的小鼠因淋巴血管无法形成在胚胎期即死亡。VEGFC杂合子的小鼠可顺利长到成年，伴随有淋巴管发育不全导致的淋巴水肿，但血管壁无明显的缺陷[14-15]。

Notch信号通路不仅在细胞的分化、增殖、凋亡及免疫应答中发挥广泛作用，也是血管新生的重要调控因素，并且通过调控血管内皮细胞的功能参与免疫应答和炎性反应等。Notch-1和Notch-4受体以及JAG-1、DLL-1、和Delta样配体4（DLL-4）均在内皮细胞表达。只有受体与相应的配体相互作用才能保证内皮细胞系的正常形态和功能，例如DLL-4/Notch-1信号传导途径中，Notch-1或DLL-4任何一方的缺失都将导致严重的血管缺陷和胚胎死亡[16]。血管前端Notch信号正向感应的降低有利于内皮细胞保持对VEGF刺激的回应，也有利于维持末梢细胞的分裂活性及血管壁的延伸[15，17]。血管网各分叉处存在另一个Notch靶点，即Nrarp蛋白，该蛋白能拮抗Notch信号并在此作用点形成血管分支。Notch和VEGFR-1的上调会抑制Nrarp的表达，Nrarp的沉默将直接导致内皮细胞增殖减弱，从而使血管形成受阻，血管网密度降低。对已形成的血管也造成了致命打击，血管网中可见到不完整的血管腔及原始血管[18]。

抗血管生成的DLL-4和促血管生成的Jagged-1共同调节Notch的激活，而Notch的激活水平将决定下一步是走VEGF/VEGFR途径还是其他信号转导途径。所有这些通路的协同作用是脉管系统形成正确构型及保持稳定性的必要条件[19]。

随后关于血管芽中Notch-VEGFR-2相互作用的研究显示，在无VEGF-A/VEGFR-2信号表达的内皮细胞中检测到了高度表达的DLL-4，表明此时的内皮细胞中也无Notch信号[18，20]。Notch信号调节并决定内皮细胞对VEGF-A的响应水平，以及VEGFR-2、VEGFR-3在内皮细胞中的表达。特异性缺失Notch和RBPJk的内皮细胞，强烈上调VEGFR-3蛋白，而不改变VEGFR-2的表达。该观察证明，Notch能有效地抑制VEGFR-3的信号表达[21]。

血管的形成并不是一个持续的过程，最近有报告显示，斑马鱼的孵化过程中昼夜节律控制着血管生成。昼夜节律调节器Bmal1直接作用于VEGF基因的启动子区域引起VEGF-A的高度表达[19，20，22]。这些数据印证了之前的报告，在小鼠的肿瘤细胞中检测到了VEGF-A的昼夜表达[19]。有趣的是，Notch信号也被这样一种昼夜节律模式调节，受Notch和FGF/MAPK通路调节的基因HES7是这种生物钟的重要组成部分[22]。在血管生成的节律性调控中是否存在Notch-VEGF-A的相互作用，目前鲜有相关报道。

上述报告的研究结果显示，血管的正常生长需要VEGFR-2、VEGFR-3和Notch信号传导途径之间的相互作用。Notch调节VEGFR-2和VEGFR-3与血管生成的相关性。此外，VEGFR-2和Notch既能单独调节VEGFR-3的表达，也能相互协同调节。VEGFR-3能在低活性的Notch信号，甚至在没有VEGF配体和VEGFR-2信号的情况下调节内皮细胞的生长。此外，VEGFR-3可通过增强Notch信号介导的巨噬细胞源性VEGF-C的活化，在血管融合点促进细胞间的稳定性。因此，VEGFR-3似乎具有促进和抑制血管生成的双重功能。这些发现引导作者去研究内皮细胞中不同程度的Notch活性所激活的不同信号通路。体外培养的血管内皮细胞组织及细胞相容性高，具有一定的生长性，如能有效地应用于临床将有望解决有限的血管来源问题。

3 Notch信号通路调控角膜内皮细胞

角膜内皮由单层均匀大小的六角形细胞通过紧密连接形成。角膜内皮细胞完整地紧密连接和正常的细胞密度是维持角膜透明性及视觉的关键。由于缺乏有丝分裂刺激因子、细胞接触抑制及房水中存在的抗促有丝分裂因子，成人角膜内皮细胞（CEC）是无有丝分裂活性的。当角膜内皮细胞损伤后，附近正常CEC扩大和迁移以填补因损伤造成的空缺，还有证据表明，CEC经过化学、机械或其他因素造成的损伤后可发生内皮间质化（EnMT），体外培养的内皮细胞也存在这种情况[23]。在此过程中，静止的内皮细胞对促分裂因子的刺激产生了反应。这种变化包括细胞形态学特征的改变以及与α-平滑肌动蛋白（α-SMA）表达增加相关的胶原产生，最终形成肌成纤维细胞。此外，N-钙粘蛋白表达的下调，伴随着Ⅳ型胶原基底膜向Ⅰ型胶原纤维膜的转换，从而产生不正常的纤维状细胞外基质[24]。

体外培养的原代大鼠角膜内皮细胞中检测到Notch相关的Jag-1、Jag-2、Notch-1、Notch-2、HES-1的mRNA的显著表达，上述所有基因，特别是Jag-2在第3代至第5代角膜内皮细胞中仍保持较高水平[24]。α-SMA及同步出现HES-1的表达是EnMT进行的一个标志，表明EnMT和Notch信号通路激活之间存在关联。加入Notch信号抑制剂DAPT后，Jag-1、Jag-2、Notch-1、Notch-2、HES-1及α-SMA的表达显著下调，而Cx43、ZO-1及N-cadherin表达增加。形态学上则表现为加入DAPT的培养基中角膜内皮细胞大部分保持着最初的均匀六边形形态，而未加DAPT的培养基中的角膜内皮细胞形态和体积均发生改变[25]。已有研究证实，转化生长因子β（TGF-β）信号通路的活化能介导兔子角膜的EnMT，同样的现象也在大鼠角膜中被证实，经TGF-β1/β2/β3处理的角膜内皮细胞长出伪足并被拉长，许多细胞丧失了缝隙连接。相反，在同时加入TGF-β及DAPT的培养基中内皮细胞仍维持着原代形态[26]。DAPT几乎完全阻断了TGF-β诱导的EnMT，证明Notch信号通路位于TGF-β信号的下游。传代的内皮细胞通常比原代细胞显示出更高的增殖和迁移活性。研究发现，DAPT应用降低了CEC的增殖率，并轻微抑制内皮细胞的迁移。有研究显示，冷冻损伤的角膜局部应用DAPT后显著减少角膜水肿，提高透明度[25，27]。这种结果可能是因为DAPT抑制了EnMT，从而保存了CEC较高的密度，促进了角膜内皮功能的恢复，这种现象有利于保护基质免于水肿混浊。

在其他细胞类型研究中所发现Notch信号和TGF-β相互作用引发多种反应。例如，TGF-β1诱导的Notch信号激活原代大鼠腹膜间皮细胞，DAPT抑制这种活化，通过抑制EnMT防止腹膜纤维化，TGF-β信号的激活还可以上调生肌细胞中HES-1的表达。被TGF-β激活的Notch也能活化和增强R-Smad蛋白的表达。这些途径调控心脏内皮细胞增殖和分化。TGF-β和Notch信号传导途径协同调节以诱导肺泡上皮细胞、肾小管和皮肤表皮的间充质化[28-30]。TGF-β和Notch信号传导途径的串扰对EnMT控制也有一定作用。同样，在胚胎心脏发育过程中，Notch信号促进TGF-β介导的EnMT，引起心脏瓣膜原基的细胞化[31]。

DAPT能抑制大鼠角膜内皮损伤修复过程中的纤维化，为人角膜内皮纤维化症的治疗提供了新靶点。也为治疗EnMT相关的纤维化疾病指明了新方向。其他的研究正在计划评估Notch抑制剂对人工内皮组织工程的益处。体外培养角膜组织的可用性可能通过抑制Notch信号，减少CEC的EnMT而增加。该方法也可以用于减少创伤眼角膜后纤维膜的形成。由于可供移植的角膜组织全球性短缺，上述结果具有潜在的临床意义。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.05.023

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:1009-5519（2015）05-0702-04

2014-09-19）

罗甜（1989-），女，湖南常德人，在读硕士研究生，主要从事眼科临床工作；E-mail：413456890@qq.com。