两种黄芪多糖提取方法比较

陈玉霞， 林 峰， 莫 娟， 杜向党

(河南农业大学 牧医工程学院, 河南 郑州 450002)



两种黄芪多糖提取方法比较

陈玉霞， 林 峰， 莫 娟， 杜向党

(河南农业大学 牧医工程学院, 河南 郑州 450002)

为了优选黄芪多糖提取的工艺，分别用水提醇沉法、微波提取法提取黄芪多糖，比较两种工艺提取黄芪多糖的提取率和提取时间，并采用紫外分光光度法测定黄芪多糖含量。结果：水提醇沉法的黄芪多糖提取率4.468%，含量29.40%；微波提取法的黄芪多糖提取率4.502%，含量31.25%。试验结果表明：微波提取法具有省时、高效、节能等优点，在提高黄芪多糖产率和有效缩短提取时间等方面优于传统的水提醇沉法，是获得较高黄芪多糖提取率及含量的方法。

黄芪多糖; 水提醇沉法; 微波提取法; 紫外分光光度法

0 引 言

黄芪是一种常见的补益类中草药，黄芪主产于甘肃、内蒙、陕西、河北及东北、西藏等地[1]。黄芪多糖是黄芪中重要的天然有效成分之一, 它具有增强机体免疫功能、强心、降压、降血糖、抗应激、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗氧化等多种药理功效，能促进免疫器官功能和抗体生成，具有双向调节血糖等作用[2-4]。自1981年黄芪多糖被提取分离以来，研究报道不断增多[5-8]，已成为中药提取及中草药现代化研究的焦点之一。目前黄芪多糖的传统提取法主要是采用蒸馏水提取工艺，该工艺简单，操作简便易行，但得到多糖粗品的收率低，加上提取成本很高，使得黄芪多糖的开发利用受到限制。为了进一步开发利用该类活性成分，许多学者在研究黄芪多糖组成、结构和产物活性的同时，对其提取分离工艺进行了研究，以期找出更合理、更可行的生产工艺。

本试验从以下几个方面考虑：黄芪多糖的收率，所提粗黄芪多糖的含糖量，整个工艺流程是否经济，保持所提的黄芪多糖具有活性。对比水提醇沉、微波辅助水提两种方法，来判断黄芪多糖提取工艺的优劣。

1 实验部分

1.1 仪 器

电子天平(Sartorius BS224S，北京赛多利斯仪器系统有限公司)，PJ23C-AN美的微波炉(广东美的微波炉制造有限公司)，紫外分光光度计(UV Bluestar 300424 ，北京莱伯泰科仪器有限公司)，RE-52旋转蒸发器(上海青浦沪西仪器厂)，超速离心机(LXJ-ⅡB型, 上海安亭科学仪器厂)，循环水式真空泵(SHZ-DⅢ，巩义市予华仪器有限责任公司)，HHS型电热恒温水浴锅(天津市华北实验仪器有限公司)，100 mL容量瓶。

1.2 药品与试剂

黄芪药材饮片(河南省药材公司)，蒸馏水(实验室自制),乙醇、丙酮、葡萄糖、苯酚和浓硫酸均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 黄芪多糖的提取分离

(1) 水提醇沉法。 精密称取黄芪饮片50 g, 加80%乙醇，回流提取2 h，滤出溶液，残渣挥干乙醇，然后加入8倍量蒸馏水加热回流提取2 h, 滤出溶液, 药材再加入8倍量的蒸馏水加热回流提取2 h,弃去滤渣合并滤液,过滤，浓缩得到浓缩液50 mL,浓缩液上超速离心机,分离过滤的滤液浓缩至50 mL,调醇度为80%,室温静置过夜12 h, 超速离心，收集白色沉淀物(一次醇沉)，并将上清液减压浓缩至50 mL，再次调醇度为80%，室温静置12 h，超速离心，弃上清液，收集白色沉淀物(二次醇沉)，合并两次得到的白色沉淀物，用丙酮洗涤2次，过滤放入干燥器中真空干燥, 即得黄芪多糖。

(2) 微波提取法。 精密称取黄芪饮片50 g，置于微波提取器中，加80%乙醇，调节功率为300 W，回流提取20 min，滤出溶液，残渣挥干乙醇，将脱脂后的药材再加入8倍量的蒸馏水，在微波炉功率300 W时加热10 min，过滤，残渣用相同方法再处理1次，弃去滤渣并合并滤液，浓缩得到浓缩液50 mL，浓缩液上超速离心机,分离过滤的滤液浓缩至50 mL,调醇度为80%,室温静置过夜12 h, 超速离心，收集白色沉淀物(一次醇沉)，并将上清液减压浓缩至50 mL，再次调醇度为80%，室温静置12 h，超速离心，弃上清液，收集白色沉淀物(二次醇沉)，合并两次得到的白色沉淀物，用丙酮洗涤2次，过滤放入干燥器中真空干燥, 即得黄芪多糖。

1.3.2 黄芪多糖的含量测定

以标准葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量。苯酚-硫酸比色法是目前黄芪多糖含量测定的主要方法之一，该法是糖在浓硫酸作用下，脱水生成糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10～100 mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在490 nm处有特征吸收峰，故可用比色法在此波长下测定[9-10]。但操作中要注意苯酚的浓度及加入量，条件选择要适当，操作要严格。

(1) 标准曲线的绘制。

葡萄糖标准液配制： 精密称取充分干燥至恒重的葡萄糖标准品10 mg，加适量蒸馏水溶解，转移至100 mL容量瓶中，加水至刻度并摇匀，配成浓度0.1 mg/mL的葡萄糖标准液备用。

5%苯酚溶液的配制： 精密称取苯酚50 g，加铝片0.1 g和碳酸氢钠0.05 g，加热蒸馏，收集182 ℃馏分，冷却，称取5.0 g，加水稀释至100 mL，摇匀后, 装入棕色试剂瓶中保存备用。

分别量取配制好的葡萄糖标准溶液(0.1 mg/mL)1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10 mL于10 mL容量瓶中加蒸馏水定容，取标准液1. 0 mL于10 mL具塞试管中，加入5%的苯酚溶液l.0 mL，摇匀后迅速加入5 mL浓硫酸显色，振荡5 min。置于沸水浴中加热30 min，取出后冷却至室温。另取1.0 mL蒸馏水同法做成空白参比溶液, 在200～700 nm范围内扫描，确定其最大吸收波长为490 nm。用紫外分光光度计在490 nm处测定吸光度A,以A为纵坐标, 葡萄糖浓度C为横坐标,求出标准回归方程。

(2) 供试品溶液的配制。 分别取两种方法提取的黄芪多糖各10 mg，加适量蒸馏水溶解后，过滤，转移至100 mL容量瓶中加水稀释至刻度，作为待测样品液。

(3) 样品含量测定。 精密吸取供试品溶液2.0 mL，于10 mL容量瓶中加蒸馏水定容，移取1. 0 mL于10 mL具塞试管中，加入l.0 mL 5%的苯酚溶液，摇匀后迅速加入5 mL浓硫酸显色，振荡5 min。置于沸水浴中加热30 min，冷却至室温，采用蒸馏水同法做空白参比溶液，分别测定吸光度A，代入标准方程C=0.212 2A-0.006 37，计算样品浓度，含量计算:

多糖含量(%) =CD/V×100

式中:C为供试液葡萄糖浓度(mg/mL )；D为试液的稀释因素；V为供试品溶液体积(mL)。

2 结果与讨论

2.1 结 果

测定结果见表1和图1。经计算得标准回归方程：C=0.212 2A-0.006 37(相关系数r=0.997 1)。两种提取工艺的提取结果见表2。两种工艺提取的黄芪多糖均为淡黄色粉末,易溶解于水,无杂质。

表1 葡萄糖标准溶液测定结果

图1 葡萄糖标准液的标准曲线

药材质量/g粗多糖提取量/g多糖提取率/%多糖含量/%水提醇沉法502.23414.46829.40微波提取法502.25104.50231.25

2.2 结果分析

本试验比较了水提醇沉法与微波辅助提取法提取黄芪多糖，黄芪多糖粗提物含量高低是评价提取工艺的重要方法，多糖含量越高，说明提取越完全。由表2可知,水提醇沉法提取黄芪多糖的含量为29.40%，微波提取法提取黄芪多糖含量为31.25%。发现在黄芪多糖提取率接近的情况下，微波提取法中得到多糖含量较多且提取率高，微波辅助提取法较水提醇沉法的提取时间缩短了将近8倍，由此可以看出,微波提取法是黄芪多糖比较理想的提取工艺。

张萍等[11]试验表明，黄芪多糖可采用水浸提、微波辅助提取，两种方法均能有效地提取多糖。采用水浸提法提取得率可达到5.31%，但提取时间长；微波对传质过程有显著强化作用，极大地缩短了黄苠多糖的提取时间；采用微波辅助提取10 min，多糖得率可达到5.96%。

微波对黄芪多糖的提取具有良好的辅助作用，能降低提取剂用量，缩短提取时间和提高多糖产率，具有省时高效节能等优点从而降低提取成本，在很多方面优于传统的水提醇沉法。

2.3 讨 论

(1) 水提醇沉法工艺。黄芪多糖的传统提取方法包括回流法和水提醇沉法[12]，就目前研究状况来看，水提醇沉法由于其方法简单、设备要求低等优点应用更为广泛，但该法提取率不高，水煮温度高,对提取物的选择性不好，会将植物细胞内的可溶性蛋白质一起溶出，在后续工艺中又不能把它们分离出来，故使所得多糖含杂质较多。朱振元等[13]在不同因素水平下优化黄芪多糖水煮醇沉法的提取条件，得出黄芪多糖最佳提取条件为提取时间2 h，提取温度80 ℃，料液比1∶10，多糖得率为9.77%；利用醇沉、DEAE-SephadexA-25和SephadexG-100进行分离纯化，得到两种黄芪多糖，纯度和糖含量较高，效果较好。

(2) 微波辅助提取法工艺。微波是指频率为300～300 GHz的电磁波，是无限电波中一个有限频带的简称。微波作为一种电磁波具有波粒二象性，基本性质通常表现为穿透、反射、吸收3个特性。微波技术在工业、农业、医学和国防等方面的研究与应用，近年来得到了很大发展。微波提取法是一种有效的新型提取方法，其具有穿透力强、选择性高、加热效率高等特点，微波辐射可以大大加快反应速度。微波作用于植物细胞壁，其热效应使细胞壁破裂和细胞膜中的酶失去活性，细胞中多糖容易突破细胞壁和细胞膜障碍被提取出来，有效地提高收率。

现代提取方法包括微波辅助提取、超声辅助提取、酶法提取等，与水提醇沉法相比，微波对黄芪多糖的提取具有很好的辅助作用，龚盛昭等[14]以水为提取剂，研究了微波辅助提取黄芪多糖的工艺，得到了微波辅助提取黄芪多糖的最佳工艺条件：液料质量比为12∶1，用饱和石灰水调节pH 9；微波功率300 W时提取2次，每次提取10 min；提取液真空浓缩后，加入乙醇使多糖沉淀，过滤；沉淀用乙醇洗涤多次，真空干燥后即得黄芪粗多糖。此法产率14.6%，纯度88.1%，与水提醇沉法相比，微波辅助提取能缩短提取时间，降低提取剂用量，提高黄芪多糖产率，具有省时、高效、节能等优点，从而降低提取成本，在很多方面优于水提醇沉法[15]。

(3) 紫外可见分光光度法。 苯酚-浓硫酸法的准确性较好，灵敏度较高，适用面较广泛，因此选择苯酚-浓硫酸法作为本实验的含量测定方法。紫外可见分光光度法测定多糖具有简便快捷、灵敏度高、准确可靠、重现性好的优点。在未来发展中，可将分离性好、准确度高的HPLC法或高效毛细管电泳法等新技术运用到对黄芪多糖的含量测定中来。

(4) 设计黄芪多糖的提取工艺。乙醇浓度的稍微不同将造成实验结果的显著差异，因此试验中要严格控制乙醇浓度为80%。

3 结 语

水提醇沉法由于其方法简单、设备要求低等优点应用更为广泛，但该法提取率不高。微波提取法中得到多糖含量较多且提取率高，省时，高效，节能，是获得较高黄芪多糖提取率及含量的理想方法。

[1] 刘瑞生.黄芪多糖提取方法研究概况[J].中国兽药杂志,2007,41(3).35-36.

[2] 韩凤兰,陆 峰,陈宇红.黄芪多糖的提取研究[J].宁夏农林科技,2004(5):21-23.

[3] Lobner M, Walsted A, Larson R,etal. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis [J]. Med Food,2008,11 (2): 313-322.

[4] Shao B M,Xu W,Dai H.A study on the immune receptors for polysaccharides from the roots of Astragalus membranaceusm,a Chinese medicinal herb[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,20(4):1103.

[5] 贺珍俊,那日苏.黄芪多糖提取工艺研究综述[R].内蒙古石油化工,2003, 29: 5-6.

[6] 金芬芬，金锡姣，杨惠鑫,等. 不同提取方法对黄芪多糖提取率影响的实验研究[J]. 中华中医药学刊,2013(10):2136-2138

[7] 李晓芳，吴 荣，叶喜德. 响应面法优化黄芪多糖提取工艺研究 [J]. 江西中医学院学报,2013(5):46-49.

[8] 董文阳，周岩民. 黄芪多糖提取方法的研究 [J].饲料研究 ,2012(7):32-34

[9 ] 翟翠云,李晓平,陶 卿.黄芪多糖含量测定方法的探讨[J].广西畜牧兽医,2007,23(1):8-9.

[10] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典[S]. 2010年版三部.北京:中国农业出版社, 2011.

[11] 张 萍,梁新丽,廖正根,等.正交设计优选黄芪多糖的微波辅助与传统提取工艺研究[J].江西中医学院报,2009,21(1):33-35.

[12] 朱虎成.黄芪多糖的提取与应用研究[J].中国动物保健，2011(3):25-26.

[13] 朱振元,刘荣强,周 芳.黄芪多糖的分离纯化和抗肿瘤活性研究[J].现代食品科技,2011,27(4): 376-379.

[14] 龚盛昭,杨卓如.微波辅助提取黄芪多糖的工艺研究[J].华南理工大学学报(自然科学 版),2004,34(8):93-98.

[15] 杨惠鑫，李敏杨，杨洁红,等. 微波辅助提取黄芪多糖的提取工艺优化研究 [J].中国中医急症,2013(1):10-11,44.

Comparison of Two Extraction Methods of Astragalus Polysaccharide

CHENYu-xia,LINFeng,MuoJuan,DUXiang-dang

(College of Animal Husbandry and Veterinary, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to investigate extraction methods of Astragalus polysaccharides, the methods of water extract-alcohol precipitation and microwave extraction were used to extract Astragalus polysaccharides. The two processes for the extraction rate and extraction time of Astragalus polysaccharides were compared and the content of Astragalus polysaccharides was calculated by using Uv-spectrophotometry. The results showed that the extraction rate of Astragalus polysaccharides was 4.468% with the Astragalus polysaccharides content of 29.40% by using water extract-alcohol precipitation method, and the extraction rate of Astragalus polysaccharides was 4.502% with the content of 31.25% by using microwave extraction. Compared with the water extract-alcohol precipitation method, the extraction time of the microwave extraction method reduced by nearly 8 times. The results indicated that microwave extraction had the advantages of high efficiency and energy saving, and it was superior to the traditional water extract-alcohol precipitation method in the improvement of the productivity and effectively shortening the extraction time of Astragalus polysaccharides. The microwave extraction is an ideal method for the highest content and extraction rate of Astragalus polysaccharides.

Astragalus polysaccharides; water extract-alcohol precipitation; microwave extraction; Uv-spectrophotometer

2014-05-29

“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAK02A03-3);河南省青年骨干教师资助计划

陈玉霞(1973-),女,河南郑州人,硕士,高级实验师,研究方向为药物分析实验技术与管理。

Tel.:13937170926;E-mail:cyx7304@163.com

林 峰(1972-)，男，山东栖霞人，博士，副教授，硕士生导师，研究方向为动物生殖生物技术。

Tel.:13838084121;E-mail:linfeng7207@163.com

R 932

A

1006-7167(2015)03-0020-03