质粒介导喹诺酮类药物耐药机制的研究现状及进展*

王垚 综述 吴疆 审校

(成都中医药大学第二临床医学院， 四川 成都 611137)

质粒介导喹诺酮类药物耐药机制的研究现状及进展*

王垚 综述 吴疆 审校

(成都中医药大学第二临床医学院， 四川 成都 611137)

喹诺酮类抗菌药物在临床中应用相当广泛，同其他抗菌药物一样，喹诺酮类也存在严重的耐药问题。质粒介导的喹诺酮类药物耐药机制(PMQR)为其耐药的重要原因，近年的研究发现PMQR主要由qnr、aac(6’)-Ib-cr、qepA和oqxAB等基因介导，这些基因介导的耐药机制及其各自的流行率存在很大差异，上述基因还能通过质粒接合而广泛传播。研究还发现上述基因与超广谱β内酰胺酶(ESBLs)等多种耐药基因存在密切联系，介导更为广泛的耐药。PMQR基因的检测技术也不断更新，新的检测技术有许多优势，可供科学研究参考。PMQR的严重性已不容忽视，需加强临床监测和合理使用抗菌药物，能有效延缓抗菌药物的抗菌周期。本文就质粒介导的喹诺酮类药物耐药机制的研究现状及进展作一综述，为临床用药提供参考。

质粒； 喹诺酮； 耐药基因； 耐药机制

喹诺酮类抗菌药物是一类含4-喹诺酮母核的全合成抗菌药物，第一个喹诺酮类药物萘啶酸，由Lesher等[1]于1962年首先发现并用于临床，到目前为止，喹诺酮类药物已发展至第四代。该类药物抗菌谱广、抗菌作用强、机制独特、高效而被广泛用于临床抗菌治疗，有研究报道其在临床抗菌治疗中的用药频度(DDDs, Drug Daily Dosages)仅次于头孢菌素类[2]。同其他抗菌药物一样，喹诺酮类药物也存在严重的耐药问题，有研究表明大肠埃希菌临床株对环丙沙星、诺氟沙星、左氧氟沙星的耐药率在75%以上[3]，阴沟肠杆菌对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率也高于40%[4]。当前已报道的喹诺酮类药物的耐药机制主要包括：①DNA 旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ基因的突变机制；②主动外排机制；③细菌外膜通透性改变；④质粒介导的诺酮喹类药物耐药。

质粒介导的喹诺酮类药物耐药机制(Plasmid-mediated quinolone resisitence ，PMQR)发现于20世纪末，该机制主要通过PMQR基因实现，第一个PMQR基因“qnr”基因(qnrA1亚型)由MartineZ等[5]于1998年首先报道，该基因来自一株膜蛋白缺失的肺炎克雷伯菌所携带质粒pMG252，能使得细菌对氟喹诺酮药物的耐药水平提高，之后PMQR逐渐成为研究的热点问题。与其他喹诺酮类耐药机制相比，PMQR介导较为低水平的耐药，但越来越多的研究表明，PMQR介导的的耐药正在向高水平耐药发展，已对临床抗菌治疗产生了一定程度的威胁，故PMQR问题的严重性已不容忽视，本文就当前PMQR相关研究现状与进展作一综述。

1 耐药机制及流行病学

目前的研究已发现三种PMQR机制，分别由qnr、aac(6’)-Ib-cr、qepA和oqxAB基因编码，介导喹诺酮类的靶位保护、药物的修饰、以及药物的外排等作用。当前报道的PMQR基因主要存在于肠杆菌科细菌中，如大肠埃希菌、克雷伯杆菌、变形杆菌、志贺菌、沙门菌等，当然，在其他非肠杆菌科中也存在PMQR，如已有报道在临床分离铜绿假单胞菌中PMQR基因阳性率高达91.8%[6]。该类基因不仅存在于患病人体中，在非患病的人体、家畜家禽、野生动物、废水以及海洋环境中均有大量分布[7～12]。PMQR基因的分布存在时间及地区差异性，不同地区基因的种类和数量分布不同，同一时间段，基因分布也存在较大差异，在对喹诺酮类药物耐药的菌株中的检出率相对较高，当然也有对随机分离菌株的直接检测，如近年来国内报道分离自动物、食物、及人体的大肠埃希菌PMQR检出率为46.3%[13]。

1.1qnr基因qnr基因家族是PMQR机制中最庞大的耐药基因家族，已发现qnrA(1-7)、qnrB(1-73)、qnrC、qnrD(1-2)、qnrS(1-9)、qnrVC(1、2-6)等六个qnr型别(http://www.lahey.org/qnrStudies; last accessed Saturday, February 22, 2014)。qnr基因的遗传环境较复杂，与多种整合子、转位子等可移动元件存在密切的联系。该基因编码的Qnr蛋白是其发挥耐药作用的主要物质。Qnr蛋白属于五肽重复家族(pentapeptide repeat proteins，PRP)，由五个串联的氨基酸残基重复而成，在五肽中每个位置上的氨基酸残基并不完全固定，相应位置的氨基酸为-[Ser, Thr, Ala, 或 Val][Asp 或 Asn][Leu 或Phe][Ser, Thr, 或 Arg][Gly][14]。不同qnr基因编码的蛋白所含的氨基酸残基总数存在差异，包含214-221个氨基酸残基，每种 Qnr蛋白之间氨基酸同源性介于32%～64%之间[15]。qnr基因介导的喹诺酮类耐药与喹诺酮作用的靶酶存在一定联系，Qnr蛋白能与细菌DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ结合，而竞争性抑制酶与DNA分子的结合，使喹诺酮药物的作用底物-拓扑异构酶Ⅳ-DNA复合体减少，使药物对细菌复制的抑制作用降低[16]。qnr基因还能提高细菌染色体基因的突变率，增加了细菌向高水平耐药的选择机会，同时qnr在一定程度上提高细菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，从而使细菌对药物产生一定程度的抵抗。

qnr基因地理分布较广泛，在亚洲、非洲、欧洲、美洲均有有报道。该基因不同型别的检出率也存在较大的地域差异，但从总体上看，qnr基因在发展中国家中检出率相对较高，如来自泰国的研究显示肺炎克雷伯杆菌中qnr基因的阳性率达48%[17]，国内聂大平等[18]报道大连地区肺炎克雷伯菌中qnr基因阳性率也高达53.2%。这与发展中国家存在的较为落后的经济条件、卫生条件、较差的生活环境以及抗菌药物的不合理使用等存在密切关系。六种qnr基因的在临床分离菌株中的检出率差异较大，qnrB基因作为qnr中最庞大的基因家族，该基因检出率相对较高，在临床分离肺炎克雷伯菌菌株中达30.8%[19]。在欧美发达国家，qnrB基因在肠杆菌科细菌中的阳性率1.7%～8.9%[20-21]，来自墨西哥的研究显示qnrB基因检出率为15.4%[22]。其余的qnr基因表现出相对较低的检出率。目前发现的一种新型qnr基因-qnrVC基因，该基因最先于2008年在巴西报道[23]qnrVC1基因，此外还存在其余五种qnrVC基因亚型，但qnrVC2为无功能基因，qnrVC4基因发现于点状气单胞菌，其与qnrVC2基因有99%的相似性，与qnrVC1、qnrVC3、qnrC、qnrS1、qnrA1、qnrB6、qnrD分别有75%、75%、68%、62%、60%、48%、34%的相似性，上述基因编码的Qnr蛋白质之间也存在极高的同源性。

1.2 aac(6’)-Ib-cr基因 aac(6’)-Ib-cr基因于2006年首次报道，该基因是aac(6’)-Ib基因第223位、454位的碱基突变导致所表达蛋白发生相应位点氨基酸的改变(Trp →Arg 和 Asp →Tyr)，最终蛋白产物较为独特，为一类氨基糖苷类乙酰转移酶，该类酶通过对含哌嗪胺为底物的喹诺酮类药物如环丙沙星及诺氟沙星进行脱乙酰化作用致使细菌对药物的敏感性降低，而对不含哌嗪胺的喹诺酮药物不起作用。近年还有报道aac(6’)-Ib-cr的变种aac(6’)-Ib-cr4基因的发现，该基因编码的蛋白质略有不同[24]，但这类基因的作用也只是局限于含哌嗪环的喹诺酮类药物。虽然报道时间较qnr基因晚，但这似乎不会对该基因拥有的较高阳性率产生影响。相关报道显示大肠埃希菌中aac(6’)-Ib-cr基因分布在太平洋地区最高[3]，余晓君等[25]报道致婴儿腹泻的鼠伤寒沙门菌中aac(6’)-Ib-cr阳性率高达37.1%；而且aac(6’)-Ib-cr在动物中同样存在较高的阳性率，其在患败血症的鸡体内筛选出的大肠埃希菌中阳性率为36.0%[26]。另外一项来自智利的报道[27]显示aac(6’)-Ib-cr在肺炎克雷伯菌中的阳性率为54%，在大肠埃希菌中高达74%。该基因在欧美国家的检出率在不同菌种中的存在较大差异，在阴沟杆菌中的检出率为2.6%[20]，在大肠杆菌中也可高达37%[27]，近年来，在全球范围内的报道表明，该基因具有全球化广泛蔓延的流行趋势。

1.3qepA基因和oqxAB基因qepA和oqxAB基因是两种较新型的PMQR基因，两种基因分别编码两种质粒介导的喹诺酮转运蛋白[15]。qepA基因有两种亚型，分别是qepA1、qepA2，qepA1于2002年被发现，2008年发现的qepA2基因，其编码的蛋白与qepA1基因编码的蛋白只有两个氨基酸的差异[29]。qepA基因编码511个氨基酸的蛋白QepA，该蛋白质属于14-跨膜节段家族载体，能选择性的将亲水性的喹诺酮类药物如诺氟沙星、环丙沙星和依诺沙星等排出菌体外，而降低药物在菌体内的蓄积量；另一方面，QepA能使暴露于喹诺酮类药物的细菌染色体上gyrA、parC亚单位的功能区更易发生突变，而使细菌向高水平耐药选择。在肠杆菌科细菌的qeqA基因中，G+C的百分含量明显高于其染色质，似乎存在某种对喹诺酮类药物的耐药特异性的表达。qeqA基因在世界范围内也存在广泛的流行，早期的数据显示，该基因流行率较低，但近年来对qepA基因的研究报道表明，其检出率较高，国内尚忠波等[30]报道qepA基因在多重耐药大肠杆菌中的检出率达14.0%；2012年厦门地区分离的大肠埃希菌中qepA基因检出率为10.5%[31]。墨西哥报道的在儿科临床分离的产超广谱β内酰胺酶基因(extended-spectrum beta-lactamase, ESBL)的肠杆菌科细菌中qepA1为1.7%[32]，国内研究人员对分离自动物、食物以及人体的大样本大肠埃希菌的研究发现，qepA基因的阳性率为3.3%[8]，另外一份来自美国的报道显示其在大肠埃希菌中检出率为9.3%[33]。

oqxAB基因包括oqxA、oqxB两种基因，于2009年才被归为PMQR基因家族，该质粒基因编码的OqxA、OqxB蛋白属RND家族的外排泵。在对pOLA52质粒上的oqxAB基因序列的研究发现，该基因上游存在的IS26侧翼序列能够介导该基因向染色体的整合[34]。oqxAB该基因的流行率也是参差不齐的，部分地区仍出现高流行的态势，国内报道的大肠埃希菌中该基因检出率可达29.3%[8]，尚有对国内食品的分析，其采集样本中oqxAB基因携带率达63.4%[35]，在意大利分离自兔体内的多耐药大肠埃希菌中的oqxAB基因检出率也达15%[36]，国内尚有在肺炎克雷伯菌中oqxAB基因阳性率为100%的报道[37]

2 质粒接合实验与耐药性转移

质粒接合实验常作为检验革兰阴性菌质粒耐药基因耐药水平的常用手段，通过将携带某种耐药基因的质粒接合到受体菌体内，培养后测定受体菌对某些药物的MIC，从而分析该质粒基因对细菌耐药水平的影响程度。比较常用的质粒接合受体菌有E．coli J53AZR、E．coli J53 RifrR、E．coli K12W1485Frif 、E．coli CSH26、E．coli Top10等，接合实验表明质粒基因能够提高受体菌的MIC值，国内廖景光等[38]相关研究表明，qnrA基因经质粒接合试验可使受体菌对对喹诺酮抗菌药的MIC值上升了5～30倍。aac(6’)-Ib-cr基因经接合后能使受体菌对环丙沙星的MIC提高至少8倍[39]。不过对qepA基因的质粒接合试验报道相对较少，但该类基因可能存在同样的现象。但有关于oqxAB基因接合实验的研究表明，临床分离携带oqxAB基因的大肠杆菌质粒接合到受体菌中，能使受体菌的MIC提高2～256倍[37]。 尽管质粒接合实验已经证明PMQR基因能提高喹诺酮药物的MIC值，但许多研究认为这种MIC值提高的程度存在一定限度，只表现为在一定程度上降低细菌对喹诺酮类药物的敏感性，很少能使细菌对喹诺酮类药物达到实际意义的耐药水平，同时有研究指出，质粒接合实验的受体菌表现的耐药水平低于供体菌，可能说明染色体介导的耐药机制在细菌耐药中仍然起着主导作用[40]。

质粒接合实验也验证了质粒耐药基因的水平传播能力，不过质粒接合实验主要以携带质粒耐药基因的革兰阴性菌为供体菌，以大肠埃希菌作为受体菌，因而质粒耐药基因在肠杆菌科中的水平传播是存在的，不过能不能更广泛地在不同种属细菌之间广泛传播还需要更多的研究来证实。另外，世界上许多地区均有报道野生动物以及家畜家禽体内细菌中存在PMQR基因，包括从市场上销售的鲜肉类中分离的细菌如沙门菌种同样存在PMQR基因[34]，而这些动物以及肉类制品在作为人类食物的同时，亦可能将其体内的PMQR传播至人体中，使人体类的常驻菌群获得PMQR基因，当出现机会感染时，这可能会对临床抗菌治疗造成巨大的威胁。

3 PMQR的特性及与PMQR相关的多种耐药基因

PMQR基因与多种耐药基因如超广谱β内酰胺酶基因、16sRNA甲基化酶基因、耐碳青酶烯酶基因、耐氨基糖苷酶基因等存在密切联系，常常在同一菌株的多个质粒或同一质粒中伴行多种耐药基因，多种耐药基因同时存在于同一可转移质粒上已有相对较高的检出率，如在产超广谱β内酰胺酶的肺炎克雷伯菌临床分离株中oqxA、oqxB基因的检出率分别高达76.3%、74.6%[41]，这些基因的同时存在，可能会进一步扩展细菌的抗菌谱，使细菌获得对多种抗菌药物的耐药性。这些基因的同时存在可能是由于细菌对多种抗生素选择作用的结果，同时也是质粒在耐药机制中的作用的综合体现。但这些质粒之间是否存在密切的相关性，如一种基因是否可以催生出另一种基因，或者一种基因诱发另一种基因的出现，以及上述质粒耐药基因之间是否存在互补增强效应，都有待于进一步研究证实。

PMQR基因可单独分布在某一个质粒中，但也可有多个PMQR基因同时存在一个质粒上，而且这种存在方式对细菌耐药水平的提高明显高于单一的PMQR基因质粒。PMQR基因多位于整合子或者其他可移动元件上，整合子还能将其他耐药基因如超广谱β内酰胺酶基因、耐碳青酶烯酶基因、质粒型Ampc酶基因等整合在一起，共同在不同菌株之间传播，增强细菌的耐药能力；而且多种抗菌药物耐药决定簇共存于同一可转移的质粒的现象，预示着任何一种抗菌药物耐药的发生都可能导致伴随的其他抗菌药物耐药基因的表达，而使得药物的抗菌作用增强，这可能会导致临床抗感染治疗的失败。

4 小结与展望

质粒作为细菌体内广泛存在的环状DNA，在细菌耐药性、致病性、代谢、共生等方面有重要作用。作为喹诺酮类耐药机制中的重要组成部分，PMQR的多样性和复杂性已有明显的体现，其在喹诺酮类药物耐药中会逐步占据主导地位，而且PMQR基因存在的复杂的基因环境以及其广泛快速的水平传播能力，使其具备足够的能力与多种耐药基因共同组成多耐药菌株，这势必给临床治疗增加难度。喹诺酮类药物的应用确实为人类做出了许多贡献，但其广泛应用所带来的严重耐药现象已不容我们忽视，因而提醒医务人员在临床医疗工作中，应注重合理规范应用抗菌药物，以最大限度地减低细菌耐药性和延长抗菌药物的疗效周期。同时，还应加强对耐药菌株的检测，为合理有效应用抗菌药物提供有利指导。

传统的基因检测方法主要是聚合酶链反应 (polymerase chain reaction，PCR)、脉冲场凝胶电泳实验(pulsed-filed gel electrophoresis，PFGE)等，近年来许多新技术运用于PMQR基因的检测上，如实时荧光定量PCR(real-time PCR) 、高分辨率熔解曲线分析 (High-resolution melt curve analysis，HRMA)[42]；与传统的方法相比，新技术有许多优势，如操作程序简单、快速、高通量、高敏感性等。real-time PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或者荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析；HRMA是结合饱和荧光染料未标记探针和实时荧光定量PCR的一种新的检测基因突变与基因分型的分子诊断技术，可以算是对real-time PCR技术的进一步改进和完善，该技术稳定可靠，不受检测位点和种类的局限，不损伤DNA，分析后可以直接纯化测序, 可结合实时荧光定量PCR对一个样品同时进行突变扫描基因分型和定量检测。上述两种技术均有用在PMQR相关基因的检测中。利用real-time PCR技术能准确的检测出多种复杂样品中的qnr[43-44]、aac(6’)-Ib-cr[43]、qepA[45]的检测，而且该技术较其他技术相比，更能快速准确检测PMQR基因[46]，HRMA技术对大样本中PMQR的检测具有更大的优势，能从大而复杂的样本中准确检测出PMQR基因。上述基因检测的新技术在诸多领域都有运用，其高灵敏度、高特异性、操作简便以及高通量低成本的优势，有望成为临床基因诊断的常规方法，对PMQR基因相关检测及新基因的发现起到重要作用。

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Recent research and progress on plasmid-mediated quinolones resistance

WANG YaoreviewingWU Jiangchecking

(TheSecondClinicalMedicalCollege，ChengduUniversityofTCM,Chengdu611137)

As widely used antibacterial agents, drug resistance restricted quinolones clinical application to extreme degree. Plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) is one of the most important part of the resistance mechanism. Recent researchers found that PMQR is mediated by the genes including qnr, c(6’)-Ib-cr, pA and oqxAB. The mechanism and prevalence of each gene is very different, and these genes could transmit through conjugation. Some researchers indicate that the PMQR genes are closely linked with other plasmid resistance genes mediated more extensive drug resistance. Some new detection with hasmany advantages can refer to scientific research. Seriousness of PMQR cannot be ignored. Strengthen clinical monitoring and rational use of antimicrobial agents is needed indeed, thus antibacterial cycle of antimicrobial agents can be effectively delayed.

Plasmid; Quinolone; Resistant gene; The mechanism of drug resistance

教育部博士点基金项目(20115132120004)

吴疆，E-mail:13518217898@163.com

R 969.3

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.07.048

2014-10-09； 编辑： 陈舟贵)