黄芪多糖和氧化苦参碱协同增强鸡新城疫疫苗免疫效果研究

陈 茜，邢玉娟，陈玉库，胡元亮，王德云，蔡丙严

(1 南京农业大学 动物医学院，江苏 南京210095；2 江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州225300)

黄芪多糖和氧化苦参碱协同增强鸡新城疫疫苗免疫效果研究

陈 茜1，邢玉娟2，陈玉库2，胡元亮1，王德云1，蔡丙严2

(1 南京农业大学 动物医学院，江苏 南京210095；2 江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州225300)

【目的】 研究黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)和氧化苦参碱(Oxymatrine,OM)对新城疫疫苗免疫的影响。【方法】 将14 日龄非免疫罗曼蛋公鸡550 羽随机均分为11 组，1～9组分别为OAP(以OM与APS质量比为6∶4配成)、OM和APS的高(4 mg/mL)、中(2 mg/mL)、低(1 mg/mL)剂量组，10组为免疫对照组，11组为空白对照组。除空白对照组外，各组试验鸡只均于14日龄首免NDV-Ⅳ系疫苗，28日龄重复免疫。在首次免疫的同时，1～9 组分别口服高、中、低剂量药物，免疫对照组和空白对照组口服等量生理盐水，每天1 次，连续3 d。分别于14，21，28，35和42 日龄采血，用MTT法测定T淋巴细胞增殖的变化，用β-微量法测定血清抗体效价变化。于14，21，28和35 日龄，每组随机抽取鸡4 羽，称体质量，剖杀，摘取法氏囊和脾脏并称质量，计算免疫器官指数。【结果】 OAP、OM、APS高、中剂量在各时间点均能促进T淋巴细胞增殖；OAP高、中剂量组在各时间点抗体效价显著高于免疫对照组；OAP高、中、低剂量组在各时间点的脾指数和法氏囊指数均显著高于免疫对照组(OAP低剂量组35日龄除外)。【结论】 黄芪多糖和氧化苦参碱能协同增强鸡新城疫疫苗的免疫效果。

中药成分复方；T淋巴细胞增殖；抗体效价；免疫器官指数

研究证明，中药及其主要成分作为一种免疫增强剂，具有来源广泛、效果显著、无毒副作用等优势，不仅能克服油乳类、铝胶类化学佐剂副作用大，局部刺激重、致癌、制备和使用麻烦或不足以提高弱抗原的免疫原性等弊病[1-4]，而且能显著增强机体的细胞免疫和体液免疫功能，促进免疫器官的发育和细胞因子的分泌[5-6]。

在前期研究中，笔者所在研究团队发现，黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)与氧化苦参碱(Oxymatrine,OM)等中药成分具有显著抑制新城疫病毒(Newsastle disease virus,NDV)增殖的作用[7]；中药成分复方在攻毒前、与攻毒同时和攻毒后给药均能显著降低受试鸡的死亡率，提高血清NDV抗体效价，减轻死亡鸡的器官出血[8]，但对于其增强免疫作用机理的研究尚未见报道。

本试验在前期研究基础上，进一步测定了中药成分及其复方对新城疫苗免疫后雏鸡外周血T淋巴细胞增殖、血清抗体效价、法氏囊指数和脾指数的影响，进一步探讨中药成分复方增强免疫的作用机理，以期为研制中药成分免疫增强剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 药物准备 根据以前的试验结果[5-6]，分别用双蒸水将OM、APS和OM-APS(OAP，以OM与APS质量比为6∶4配成)配制成高(4 mg/mL)、中(2 mg/mL)、低(1 mg/mL) 3 种质量浓度的溶液，常规消毒后备用。

1.1.2 疫苗和病毒 新城疫Ⅳ系(Newcastle disease virus Ⅳ strain，NDV-Ⅳ)疫苗，中牧股份南京药械厂生产，批号753-3。新城疫检测抗原，由南京农业大学动物医学院中兽医研究室提供。新城疫强毒E01株，由江苏省农业科学院兽医研究所禽病研究室提供。将病毒按常规方法接种9 日龄SPF鸡胚，恒温培养72 h，收获尿囊液，按Reed-Muench法[9]测定鸡胚半数感染量(Egg infectious dose,EID50)为10-8.83。

1.1.3 主要试剂 RPMI1640培养液，Gibco公司产品，按说明书用三蒸水配制后过滤除菌，分装，4 ℃保存，临用前加入犊牛血清达体积分数5%，同时加青霉素、链霉素各100 IU/mL；植物血凝素(PHA)，上海伊华科技有限公司产品，用RPMI1640培养液配制成0.1 mg/mL，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装后-20 ℃保存；四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液，Amresco公司产品，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，使最终质量浓度为5 mg/mL，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装后4 ℃冰箱避光保存；淋巴细胞分离液，上海恒信化学试剂有限公司产品；淋巴细胞裂解液二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，苏州正兴化工研究院产品。

1.1.4 试验动物 1 日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡600羽，购自汤泉农垦种鸡场。试验期间采用笼养，全价饲料，自由采食和饮水，1～14 日龄采用红外灯保温，全日制光照。

1.2 试验设计

雏鸡饲养至14 日龄(平均体质量95 g/只)，平均母源抗体效价3.3时，随机选取550羽均分为11 组。第1～9 组为OAP高(OAPH)、OAP中(OAPM)、OAP低(OAPL)、OM高(OMH)、OM中(OMM)、OM低(OML)、APS高(APSH)、APS中(APSM)和APS低(APSL)，第10组为疫苗对照组，第11 组为空白对照组隔离饲养。除空白对照组外，其他组试验鸡于14日龄首免，用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、点眼免疫，每羽1 羽份；28 日龄时重复免疫。在首次免疫的同时，3 个中药复方组分别口服高、中、低剂量的OAP复方，每羽1 mL，6 个单味药组分别口服高、中、低剂量的OM和APS，每羽1 mL，免疫对照组和空白对照组口服等量生理盐水，每天1 次，连续3 d。分别于14，21，28，35和42 日龄，每组随机取鸡4 羽，无菌心脏采血(4.0 mL/羽)，肝素抗凝，测定外周血淋巴细胞增殖；每组随机另取鸡10 羽翼静脉采血，分离血清，用β-微量法测定HI抗体效价。在14，21，28和35 日龄，每组随机取鸡4 羽，称体质量，剖杀，摘取法氏囊和脾脏并称其质量，计算免疫器官指数(免疫器官质量/体质量×100%)。

1.3 淋巴细胞增殖的测定

采用MTT法[10]，将抗凝血样用Hank’s液稀释1 倍，小心加在淋巴细胞分离液上层，2 000 r/min离心20 min，吸取中间云雾状白细胞层，用无血清RPMI1640培养液洗2 遍，1 500 r/min离心15 min。台盼蓝染色，细胞计数活细胞大于90%后，用RPMI1640培养液调整细胞密度为2.5×106个/mL，加入到96 孔细胞培养板(德国Nunclon公司生产)中，80 μL/孔，每孔再加20 μL PHA，每个样品重复4 孔，然后置于39.5 ℃、体积分数5% CO2条件下(CO2培养箱，美国Revco公司产品)培养44 h，然后每孔加入MTT溶液20 μL，继续培养4 h后，每孔加裂解液100 μL，将细胞板置于微量振荡器(75-2A型，上海医用分析仪器厂生产)上振荡5 min使沉淀完全溶解，在酶联免疫仪(DG-3022型，中国华东电子管厂生产)上于570 nm处检测吸光值(A570)作为T淋巴细胞增殖的指标。

1.4 抗体效价的测定

在96孔微量血凝板上，从左到右每孔各加50 μL PBS液，再向每排的第1 孔加入50 μL待检血清，依次向后倍比稀释直至第12 孔，然后向每孔加入50 μL 4 单位抗原，在微量振荡器上振荡混匀后置于温箱中感作20 min。取出血凝板向每孔加入50 μL 鸡红细胞悬液，同时设阳性血清、阴性血清及空白对照孔。振荡混匀后置于37 ℃温箱中感作30 min，待对照孔红细胞已经沉淀时观察结果[9]。

1.5 数据处理

淋巴细胞A570值、HI效价和免疫器官指数以“平均值±标准差”表示。用SPSS 11.0软件进行统计分析，比较各时间点淋巴细胞转化、抗体效价和免疫器官指数的差异性。

2 结果与分析

2.1 OM、ASP和OAP对鸡淋巴细胞增殖的影响

OM、ASP、OAP不同剂量和免疫对照组各时间点A570值均显著高于空白对照组(P<0.05)；与免疫对照组相比较，OAPH、OAPM、OMH、OMM、APSH、APSM在各时间点，OAPL、APSL在21，28，35和42日龄，OML在21，28和42日龄的A570值显著升高(表1)。

OAPH在各时间点A570值均显著高于OMH和APSH(P<0.05)；OAPM在28日龄A570值高于APSM，但差异不显著，其余各时间点其A570值均显著高于OMM和APSM(P<0.05)；不同剂量复方组和OMH、APSH在21 日龄A570值达到高峰，其余各单味药及对照组在28 日龄达到高峰(表1)。

注：同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference (P<0.05).The same below.

2.2 OM、ASP和OAP对鸡抗体效价的影响

由表2可知，OM、ASP、OAP各剂量组和免疫对照组试验鸡各时间点抗体效价均显著高于空白对照组(P<0.05)；OAPH和OAPM在14～42日龄，APSM和OMM在21～42日龄，APSH在21,35，42日龄,OAPL在21，28，35日龄，APSL、OMH在21日龄抗体效价显著高于免疫对照组(P<0.05)。

OAPH的抗体效价在各时间点均显著高于OMH和APSH(P<0.05)；OAPM抗体效价在21，28，35和42 日龄显著高于OMM，在21，28和35 日龄显著高于APSM(P<0.05)；OAPL抗体效价在28 日龄显著高于OML(P<0.05)(表2)。

2.3 OM、ASP和OAP对鸡免疫器官指数的影响

2.3.1 法氏囊指数的变化 由表3可知，OAPL、OMH、OML、免疫对照组和空白对照组的法氏囊指数在21 日龄达到峰值，其他各组在28 日龄达到峰值；各药物组及免疫对照组法氏囊指数均显著高于空白对照(P<0.05)；OAPH、OAPM、OMM、OML、APSH、APSM、APSL在各时间点，OMH在21和28日龄及OAPL在14，21和28日龄法氏囊指数显著高于免疫对照组(P<0.05)。OAPH的法氏囊指数在各时间点均显著高于OMH，在28和35 日龄显著高于APSH，OAPM的法氏囊指数在35 日龄显著高于OMM和APSM(P<0.05)。

2.3.2 脾指数的变化 由表4可知，OAP各剂量组、OMM、APSH、APSM在各时间点、OMH在14和35日龄、OML和APSL在14，21和35日龄脾指数显著高于空白对照组(P<0.05)；OAP各剂量组、OMM、APSH、APSM在各时间点及OML在21日龄和APSL在14，21 日龄的脾指数均显著高于免疫对照组(P<0.05)。

OAPH在各时间点的脾指数均显著高于OMH；OAPM在21，28和35 日龄的脾指数显著高于OMM，在28 日龄显著高于APSM；OAPL在14和28 日龄脾指数显著高于OML(表4)。

3 讨 论

3.1 中药成分复方及其组分药对淋巴细胞增殖的影响

淋巴细胞增殖是反映机体细胞免疫水平的一个重要指标[11]。细胞免疫是通过致敏淋巴细胞与相应抗原作用而发挥抗病原体感染、抗肿瘤、帮助B淋巴细胞产生抗体等作用。本试验结果表明，9 个试验药物组中，除OAPL、OML、APSL在14 日龄，OML在35 日龄A570与免疫对照组无显著差异外，其余各组在各时间点的A570值均显著高于免疫对照组。提示OAP、APS和OM在合适的剂量均能刺激淋巴细胞增殖，促进细胞免疫，且以OAPM、OAPH的效果最好。

3.2 中药成分复方及其组分药对新城疫苗免疫应答的影响

血清抗体效价反映机体体液免疫状态[12]，体液免疫是机体抗御感染的主要因素之一，通过抗原-抗体结合反应而起到抗菌、抗病毒、抗外毒素等多种作用。本试验结果表明，OAPH、OAPM在5个时间点、OMM和APSM在4 个时间点、OAPL和APSH在3 个时间点、OMH和APSL在1 个时间点的抗体效价均显著高于免疫对照组。表明OAP、APS和OM在合适的剂量均能刺激抗体产生，提高机体体液免疫水平，其中以OAPH、OAPM和APSM的作用较强。

3.3 中药成分复方及其组分药对免疫器官指数的影响

一般认为，免疫器官指数降低为免疫抑制所致，而免疫器官指数增加则为免疫增强的表现[13]。本试验中，OAPH、OAPM在各时间点的法氏囊指数、脾指数均显著高于免疫对照和空白对照组，OAPL在14，21和28 日龄的法氏囊指数和各时间点的脾指数显著高于免疫对照组。除OMH在14和35 日龄以及OAPL在35 日龄的法氏囊指数高于免疫对照组但差异不显著外，其余各药物组法氏囊指数均显著高于免疫对照组。在脾指数方面，OMH在各时间点，OML在14，28和35 日龄，APSL在28和35 日龄与免疫对照组无显著差异，其余各组、各时间点均显著高于免疫对照组。表明中药成分复方及其组分药能增加免疫器官质量，从而增强机体的免疫功能。

3.4 中药成分复方及其组分药增强免疫作用的量效关系

本试验发现，OAP增强免疫作用有一定的量效关系。在促进T淋巴细胞增殖方面，OAPH、OAPM在各时间点均显著高于免疫对照组，而OAPL在14 日龄与免疫对照组无显著差异。OM和APS的高、中剂量组各时间点的A570值与免疫对照组相比较差异显著，而低剂量组在14 日龄与免疫对照组无显著差异，这可能是因为剂量过小，不足以刺激机体产生致敏淋巴细胞所致，具体原因还有待于进一步研究；在提高血清抗体效价方面，OAPH、OAPM在各个时间点均显著高于免疫对照组；OAPL在21，28和35 日龄显著高于免疫对照组。在提高法氏囊指数方面，OAPH、OAPM各时间点的法氏囊指数显著高于免疫对照组；OAPL在14，21和28 日龄显著高于免疫对照组，在35 日龄与免疫对照组相比较差异不显著。Kong等[14]在观察9种中药成分对新城疫Ⅳ系疫苗免疫雏鸡血清中血凝抑制抗体水平影响的研究中，也得到了类似结果。

3.5 中药成分复方与其单味组分药增强免疫作用的比较

在促进T淋巴细胞增殖方面，OAPH的A570值显著高于OMH和APSH；在提高血清抗体效价方面，OAPH抗体效价显著高于OMH和APSH；在提高免疫器官指数方面，OAPH的法氏囊指数显著高于OMH。OAP是由OM和APS组成的复方，其增强免疫作用优于单味组分药，表明两种组分药有协同作用。王德云等[15-16]在研究当归多糖、黄芪多糖、淫羊藿多糖、蜂胶黄酮等提高免疫调节作用时亦发现，中药成分复方的免疫活性优于其单味组分。

综合以上结果可见，OAP能显著增强雏鸡对新城疫疫苗的免疫应答，且中、高剂量的效果较好，显著优于单味组分，可作为新型免疫增强剂的候选方。

[1] 沈留红，邓惠丹，邓俊良，等.“禽康散”对人工感染NDV肉鸡红细胞免疫功能的影响 [J].扬州大学学报：农业与生命科学版,2013,34(2):16-19.

Shen L H,Deng H D,Deng J L,et al.The changes of red blood cell immune function by complex Chinese crude drug “Qinkangsan” on chicken artificially challenged by NDV [J].Journal of Yangzhou University:Agricultural and Life Science Edition,2013，34(2)：16-19.(in Chinese)

[2] 张宝康，王德云，孔祥峰，等.蜂胶黄酮增强免疫作用的研究 [J].扬州大学学报：农业与生命科学版，2006，27(3)：20-22.

Zhang B K,Wang D Y,Kong X F,et al.Studies on immunoenhancement of propolis flavone [J].Journal of Yangzhou University:Agricultural and Life Science Edition,2006，27(3)：20-22.(in Chinese)

[3] 韩庆功，崔艳红，赵玉军.免疫增强剂在鸡疫病防治中的应用 [J].兽药与饲料添加剂，2006，11(2)：19-22.

Han Q G,Cui Y H,Zhao Y J.The application of immune enhancer in chicken disease prevention [J].Veterinary Pharmaceuticals & Feed Additives,2006,11(2):19-22.(in Chinese)

[4] 龚晓明，吴耀妹.免疫佐剂研究的现状与趋势 [J].中国兽医杂志，1996，30(1)：41-43.

Gong X M,Wu Y M.The present situation and development trend of immune adjuvant research [J].Chinese Journal of Veterinary Medicine,1996,30(1):41-43.(in Chinese)

[5] 郭振环，胡元亮，马 霞，等.硫酸化香菇多糖对新城疫疫苗免疫效果的影响 [J].南京农业大学学报，2010，33(1)：76-80.

Guo Z H,Hu Y L,Ma X,et al.Adjuvanticity of sulfated lentinan for Newcastle disease vaccine [J].Journal of Nanjing Agricultural University,2010,33(1):76-80.(in Chinese)

[6] Ma X,Guo Z H,Wang D Y,et al.Effects of sulfated polysaccharides and their prescriptions on immune response of ND vaccine in chicken [J].Carbohydrate Polymers,2010,82:9-13.

[7] 陈玉库，邢玉娟，蔡丙彦，等.四种中药成分复方抗NDV感染CEF细胞筛选效果分析 [J].江苏农业科学，2008(5)：176-179.

Chen Y K,Xing Y J,Cai B Y,et al.Effects of Compound Chinese Herbal Medicinal ingredient on NDV infecting chick embryo fibroblast [J].Jiangsu Agricultural Sciences,2008(5):176-179.(in Chinese)

[8] Chen Y K,Wang D Y,Hu Y L,et al.Astragalus polysaccharide and oxymatrine can synergistically improve the immune efficacy of Newcastle disease vaccine in chicken [J].International Journal of Biological Macromolecules,2010,46:425-428.

[9] 殷 震，刘景华.动物病毒学 [M].2版.北京:科学出版社，1997.

Yin Z,Liu J H.Animal virology [M].2nd ed.Beijing:Science Press,1997.(in Chinese)

[10] 刘 钊，杨占秋，肖 红，等.MTT法在抗病毒药物筛选中的应用 [J].武汉大学学报:医学版，2004，25(3)：333-336.

Liu Z,Yang Z Q,Xiao H,et al.A simple and rapid method of MTT assay for evaluation of antiviral activity [J].Medical Journal of Wuhan University,2004,25(3):333-336.(in Chinese)

[11] Huang Y,Jiang C M,Hu Y L,et al.Immunoenhancement eff-ect ofRehmanniaglutinosapolysaccharide on lymphocyte proliferation and dendritic cell [J].Carbohydrate Polymers,2013,96:516-521.

[12] Fan Y P,Ma L,Zhang W M,et al.Microemulsion can improve the immune-enhancing activity of propolis flavonoid on immunosuppression and immune response [J].International Journal of Biological Macromolecules,2014,63:126-132.

[13] Grossman C J.Interration between the gonadal steroids and the immune system [J].Science，1995，227:357-261.

[14] Kong X F,Hu Y L,Li X R.Effects of Chinese herbal medicinal ingredients on peripheral lymphocyte proliferation and serum antibody titer after vaccination in chicken [J].Int Immunopharmacol,2004,35(4):468-472.

[15] 王德云，胡元亮，孙峻岭，等.复方中药成分对新城疫疫苗免疫雏鸡外周血T淋巴细胞转化和血清抗体效价的影响 [J].中国兽医学报，2006，26(2)：194-196.

Wang D Y,Hu Y L,Sun J L,et al.Effect of Chinaese Herbal Medicinal ingredient prescription on periphral T lymphocyte transformation and serum antibody titer of chickens inoculated with ND vaccine [J].Chin J Vet Sci,2006,26(2):194-196.(in Chinese)

[16] Wang D Y,Li X R,Hu Y L,et al.Immunologic synergism with IL-2 and effects of cCHMIs on mRNA expression of IL-2 and IFN-γ in chicken peripheral T lymphocyte [J].Vaccine,2006,24:7109-7114.

Increasing immune efficacy of Newcastle disease vaccine in chicken by astragalus polysaccharide and oxymatrine

CHEN Xi1,XING Yu-juan2,CHEN Yu-ku2,HU Yuan-liang1,WANG De-yun1,CAI Bing-yan2

(1CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jiangsu210095,China;2JiangsuAgri-animalHusbandryVocationalCollege,Taizhou,Jiangsu225300,China)

【Objective】 This paper aimed to study the immune effect of astragalus polysaccharide (APS) and oxymatrine (OM) on Newcastle disease vaccine.【Method】 Five hundred and fifty 14-day-old non-immunized Roman cocks were randomly divided into 11 groups.Groups 1 to 9 were OAP (OM and APS quality ratio of 6∶4),OM and APS at high (4 mg/mL),medium (2 mg/mL) and low (1 mg/mL) doses,respectively.Group 10 was vaccine control and group 11 was blank control.Groups 1 to 10 were vaccinated with NDV-Ⅳ at the ages of 14 and 28 days,respectively.At the same time of the first vaccination,the chickens in groups 1 to 9 were given compounds at high,medium and low doses and chickens in vaccination and blank control groups were given physiological saline by oral administration,once a day for three days. On days 14,21,28,35 and 42,peripheral T lymphocyte proliferations and serum antibody titers were determined with MTT method and β-microscopic method,respectively.On 14,21,28 and 35 days,the organ indexes of spleen and bursa were determined by killing 4 chickens in each group.【Result】 T lymphocyte proliferations were promoted by OAP,OM and APS at high and medium doses and serum antibody titers of OAP at high and medium doses were significantly higher than those of vaccine control group.At any time,spleen and bursa indexes of OAP at all doses were significantly higher than those of vaccine control group (except the OAP low dose group for 35-day old chicken).【Conclusion】 APS and OM could synergistically improve the immune efficacy of Newcastle disease vaccine in chicken.

Chinese herbal medicinal ingredients compounds;T lymphocyte proliferation;antibody titer;immune organ index

2014-05-27

国家科技支撑计划项目(2008BADB4B06)；国家大学生创新性实验计划项目(2013110307038)

陈 茜(1992-)，女，内蒙古通辽人，本科在读，主要从事中兽药药理学研究。E-mail：1903048596@qq.com

胡元亮(1953-)，男，江苏邳州人，教授，博士，博士生导师，主要从事中兽医学研究。E-mail：ylhu@njau.edu.cn

时间:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.028

S853.7

A

1671-9387(2015)06-0041-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.028.html