溶杆菌属细菌鉴定及生防机制概况

王 娜，武坤毅，崔浪军，章华伟

(1 陕西师范大学 生命科学学院，药用植物资源与天然药物化学教育部重点实验室，陕西 西安 710062；2 浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

溶杆菌属细菌鉴定及生防机制概况

王 娜1，武坤毅1，崔浪军1，章华伟2

(1 陕西师范大学 生命科学学院，药用植物资源与天然药物化学教育部重点实验室，陕西 西安 710062；2 浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

溶杆菌属的大部分细菌具有重要的生防前景，因而受到了高度关注。为了明确目前溶杆菌属细菌的研究现状，分析了已报道的26种溶杆菌属细菌的分布环境及典型的生化特征，基于16S rDNA序列相似性和脂肪酸组成构建了26种溶杆菌属细菌的系统进化树，并辅以DNA-DNA杂交结果进行佐证，阐述了溶杆菌属细菌对病原菌、线虫病害的生物防治物质及其作用机理，并对其生物安全和应用前景进行了展望。

溶杆菌属；细菌鉴定；DNA-DNA同源杂交；生物防治

溶杆菌属(Lysobacterspp.)属于变形杆菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gmmaproteobaeteria)、黄单胞菌目(Xanthomonadaceae)、黄单胞科(Xanthomonadaeeae)。早在1966年，有研究者发现，有1株细菌能产生堆囊黏菌素，这种堆囊黏菌素是一种吩嗪类抗生素，对大多数细菌和真菌具有广谱的抑制作用[1]。在此基础上，1978年，Christensen等[1]在加拿大举行的细菌分类学大会上首次提出溶杆菌属，该属与假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、 寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、热单胞菌属(Thermomonas)和木杆菌属(Xylella)等的亲缘性较近[2]。目前已报道的溶杆菌属的大多数细菌对病原真菌、G+细菌、线虫和绿藻均有突出的拮抗作用[3]。随着近年来溶杆菌属新种的不断发现，该属细菌在生物防治领域巨大的应用前景受到高度关注。本研究就溶杆菌属细菌的主要鉴定特征和生物防治病虫害机制的最新研究进展进行综述，以期为该属细菌的开发利用提供参考。

1 溶杆菌属细菌种类

在溶杆菌属提出之前，大部分细菌新种的分类和鉴定是根据滑动性和溶菌活性将具有相似表型的细菌分开。1978年，Christensen等[1]发现了溶杆菌属细菌，虽然其与黏细菌表型相似，但不具有黏细菌产生子实体的特征，且溶杆菌属细菌DNA的G+C含量大于60%，而黏细菌DNA的G+C含量相对较低[3]。因此，溶杆菌属作为一个新属被提出。

溶杆菌属自1978年命名以来，截至2012年底，在国际菌种鉴定权威杂志《国际微生物体系分类学》(IJSEM)期刊上命名的溶杆菌属细菌有26种[1,2,4-22]。如表1所示，在这26种溶杆菌属细菌中，在韩国发现的有12种，在中国发现的有7种，其余7种分别在加拿大、印度和菲律宾被发现；这些细菌中除5株是在淡水、胡椒根系、水系沉积物、深海海绵和水稻根系中发现的外，其余21株均在不同类型的土壤中被发现。这些土壤类型包括湿度相对较大的温室土壤和人参根际土壤、受强紫外线或地热辐射的干燥土壤、金属矿集区土壤、被厌氧细菌或百菌清严重污染的土壤，其中在湿度相对较大土壤中发现的种类较多，说明溶杆菌属细菌在土壤中有广泛的适应性。

2 溶杆菌属细菌的生化特征

溶杆菌属菌株菌体呈杆状，两端钝圆，单生，大小一般为(0. 2～0. 5) μm×(2～70) μm[23]，无鞭毛，但具有滑行能力，表面光滑有规则，好氧性强，革兰氏染色阴性，无芽孢，能够生长的温度为15～42 ℃，最适生长温度为25～40 ℃，大部分可以在TSA、NA和LB培养基上生长，菌落颜色有奶油色、淡黄、黄色几种[1,2,4-22]。细菌不同种之间的表型差异很小，仅凭形态学特征难以区分和鉴别，需要根据其生理生化指标的差异进行分析与鉴定。

综合前人的研究成果[1,2,4-22]可知，G+C含量高(61.7%～70.7%)且含有辅酶Q-8是溶杆菌属细菌的2个标志性特征。其他特征还有：氧化酶(L.koreensis、L.ximonensis除外)、过氧化氢酶(L.daejeonensis、L.yangpyeongensis和L.panaciterrae除外)检测结果为阳性；硝酸盐还原性(L.daejeonensis、L.brunescens和L.defluvii除外)检测结果为阴性；大部分能水解利用七叶树素(L.daejeonensis、L.antibioticus、L.concretionis、L.niaboensis、L.niastensis和L.spongiicola除外)和明胶(L.korlensis除外)；α-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶等细菌代谢关键酶活力大部分检测显示阴性。溶杆菌属细菌对营养要求相对较低，碳源的利用范围广泛，能利用D-葡萄糖、D-树胶醛醣、D-甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖等单糖，还可以利用麦芽糖等二糖以及糖原等多糖，也能利用其他碳源，如苹果酸、柠檬酸钠；但其中一部分细菌如L.dokdonensis、L.ruishenii和L.daecheongensis对碳源的利用情况尚不清楚，还有待进一步研究。这些结果表明，用传统的经典分类方法，仅仅依据形态特征和生理生化特性进行溶杆菌属种的确定是不够的，因此还需要采用其他有效的分析手段对其进行分类研究。

3 基于16S rDNA序列的溶杆菌属细菌的进化分析

由于细菌的全基因组数量迅速增加，利用比较基因组学能更清晰地分析基因组进化。通过基因组分析可以识别噬菌体或其他具有DNA的区域，从而预测是否发生基因水平转移，分析相关基因组之间的演变，也可说明距离较远的发育相关细菌之间的关系[2]。16S rDNA基因大小1.5 kb 左右,含有高度保守的基因片段，同时在不同的菌株间也含有变异的核酸片段。通过对其序列的分析，结合完善的数据库，可以简单、快速地对细菌进行分类鉴定，确定细菌在进化中的位置，是细菌分类学中非常重要的方法[24]。当鉴定同源性较高的细菌时，可用其他方法作为补充。

对表1中26种溶杆菌属细菌的16S rDNA基因序列进行同源比对，并用MEGA 4.0软件包中的Kimura-2-parameter法计算遗传距离，用Neighbor-Joining法构建系统发育树,结果见图1。由图1可知，L.thermophilus和L.xinjiangensis分成2个单独的分支，其他24株细菌分成了4个单独但相关的集群。

由图1可知，L.gummosus，L.antibioticus，L.capsici，L.niastensis，L.soli，L.enzymogenes，L.xinmonensis，L.dokdonensis，L.ginsengisoli，L.panaciterrae，L.brunescens和L.daecheongensis组成1个集群；L.daejeonensis，L.ruishenii，L.defluvii，L.spongiicola，L.concretionis和L.arseniciresistens组成1个集群；L.koreensis，L.niabensis，L.yangpyeongensis和L.oryzae组成1个集群；L.bugurensis和L.korlensis组成1个集群。26种溶杆菌属细菌中，L.capsici与L.gummosus和L.antibioticus16S rDNA序列的相似百分率为100%，三者相似性最高；其次是L.daejeonensis与L.ruishenii，其16S rDNA序列相似百分率为98%，二者相似性较高。该系统发育进化树清楚地说明了这26个溶杆菌属细菌之间的亲缘性关系。

目前，采用16S rDNA测序方法鉴定细菌亲缘关系时主要依靠序列间的相似百分率。Bosshard等[25]将16S rDNA序列相似百分率大于99%的细菌定义为同种内的不同亚种，相似性在95%～99%的则定义为属内相关的种。但随着细菌基因组测序的发展，发现16S rDNA序列相似百分率即使达到99%以上，在分类学上也可能属于不同的种[26]，说明对细菌进行系统分类鉴定不能采取单一的标准。如L.capsici与L.gummosus和L.antibioticus的 16S rDNA序列相似百分率为100%，三者之间同源性很高，但为不同的种。因此，必须同时结合DNA同源杂交、形态特征、生理生化特征、脂肪酸含量测定等多项指标进行综合分析，才能给予溶杆菌属新种准确的鉴定结论[27]。

4 基于脂肪酸组成的溶杆菌属细菌的聚类分析

脂肪酸具有结构多样性和较高的生物学特异性，是特别有效的生物标记物[28]。通过微生物脂肪酸的组分来鉴定微生物的种属，分析微生物的多样性，是一种简便、可靠的分析方法。根据26种溶杆菌属细菌脂肪酸含量的百分比可知，溶杆菌属细菌标志性的脂肪酸主要是iso-C15:0、iso-C16:0和iso-C17:1ω9c，其中iso-C15:0的含量相对最高。根据26种细菌的脂肪酸含量，用SPSS 18.0中的聚类分析(Hierarchicalcluster)以类间平均连锁法(Between-groups linkage)进行聚类，通过平均距离法制图，结果如图2所示。

由图2可见，全部26种细菌聚为一类时，类合并距离尺度为25；在距离尺度仅约为10时可分为4类，其结果与基于16S rDNA序列相似性构建的系统进化树分类结果保持相对较高的一致性，这与前人在其他革兰氏阴性菌中的研究结果[28]一致。在这26种细菌中，L.ruishenii与L.ginsengisoli为2个单独的分支，L.gummosus、L.panaciterrae、L.soli、L.niastensis、L.daecheongensis、L.enzymogeneL.capsici和L.antibioticus组成1个集群，L.bugurensis和L.korlensis组成1个集群，其余的组成1个集群。

由图2还可知，具有相似脂肪酸组成的细菌聚合为单一集群，这些细菌来自相近的环境，其16S rDNA序列具有较近的“亲缘关系”(图1)。如L.daejeonensis、L.yangpyeongensis、L.dokdonensis等均分离自相对潮湿的土壤，这些细菌在16S rDNA序列相似性和脂肪酸组成上保持高度一致。此外，均分离自中国干旱地热土壤中的L.xinjiangensis和L.thermophilus等细菌之间，也存在16S rDNA序列相似性和脂肪酸组成保持高度一致的现象。以上结果有力地说明，环境因素极可能对脂肪酸组成造成影响，相似环境下的细菌具有更为相似的脂肪酸组成。

5 溶杆菌属细菌的DNA-DNA同源性杂交鉴定

细菌分类学上不同物种之间能进行DNA同源杂交，其基本原理是用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外加热解链，并在合适条件下使互补的碱基重新配对，测算杂交百分数。百分数越高，杂交的2个DNA碱基线性序列的同源性就越高，说明其亲缘关系就越近[29]。因此通过DNA同源杂交鉴定物种之间的亲缘关系，是细菌鉴定中最为重要的证据。按照国际分类委员会的建议，将DNA同源性70%作为定种的界限，即同源性≥70%为同一个种群，同源性<70%为不同种群[28]。例如通过DNA同源杂交鉴定溶杆菌属新菌株L.ginsengisoliGsoil357T、L.daecheongensisDae08T和L.spongiicolaKMM329T，结果表明L.ginsengisoliGsoil357T与L.gummosusDSM6980T、L.antibioticusDSM2044T之间的DNA同源性分别为16.3%和16.2%[19]，L.daecheongensisDae08T与L.brunescensDSM6979T之间的DNA同源性为28%[15]，L.spongiicolaKMM329T与L.concretionisKCTC12205T之间的DNA同源性为48%[9]，因此鉴定L.ginsengisoliGsoil357T、L.daecheongensisDae08T和L.spongiicolaKMM329T为溶杆菌属中独立的种。但最新的研究表明，即使溶杆菌属2种细菌的16S rDNA序列相似率达到99%以上，二者基因组DNA杂交同源性百分数也可能远在70%以下[30-31]，而且其生理生化指标、细胞化学组分等方面的特征也有明显的差异，在分类鉴定中可命名为不同的种，这对于新种的确定和细菌不同种的鉴定提供了准确、快速、有效的证据[27]。如1978年，Christensen 和Cook 提出了L.enzymogenes细菌的亚种，命名为L.enzymogenes，但此亚种的名称在细菌命名中一直未得到批准，该名称的术语也未被验证[5]。最新研究报道表明[26]，此亚种细菌L.enzymogenesPAGU1119T与L.enzymogenesDSM2043T、L.capsiciYC5194T之间16S rDNA序列的相似率分别为97.2%和99.4%，全基因组DNA同源杂交百分数分别为20.7%～26.1%和60.9%～62.0%，这说明与L.enzymogenesDSM2043T细菌相比，L.enzymogenesPAGU1119T与L.capsiciYC5194T的亲缘关系更近。但进一步的试验分析表明，L.enzymogenesPAGU1119T与L.capsiciYC5194T的生化特征、脂肪酸含量等特征差异性较大[26]，因此Kawamura等[26]提出，将L.enzymogenesPAGU1119T视为溶杆菌属1个独立的新种，并重新命名为L.cookiisp.。

6 溶杆菌属细菌的生防物质及作用机理

已报道的溶杆菌属的大多数细菌对许多病原菌有显著的拮抗作用[3]。截至2012年底，溶杆菌属26种细菌中，只有L.enzymogenesC3等少数几种细菌的胞外主要抑菌物质被分离得到，这些物质主要有胞外酶、小分子化合物及生物表面活性剂和抗生素3大类(表2)。

6.1 胞外酶

与其他生防菌相比，溶杆菌属细菌能够分泌几丁质酶、β-1, 3-葡聚糖酶等多种胞外酶。如L．enzymogenesC3、L.enzymogenesOH11能大量分泌几丁质酶，该酶通过水解病原真菌细胞壁抑制其增殖，从而提高植物的抗真菌能力[34]。L．antibioticusHS124、L.enzymogenesOH11分泌的β-1,3-葡聚糖酶通过催化细胞壁中的β-1, 3-葡聚糖多聚体水解,将其降解为葡萄糖，从而抑制真菌的生长及增殖[47]。L.enzymogenes3.1T8分泌的α-水解蛋白酶能降解线虫体壁的蛋白质，该蛋白酶由前肽区(Pro)和蛋白酶区(Alp)组成，其中前肽区参与该酶的正常折叠，影响其水解活性[36]。

6.2 小分子化合物

溶杆菌属细菌分泌于胞外的活性小分子物质主要包括HSAF、WAP-8294A2、Lysobactin、Cephabacins和Tripropeptins等，其中L.enzymogenesC3、L.enzymogenesOH11分泌的热稳定抗真菌因子(HSAF)对丝状真菌和卵菌有显著的抑制作用。HSAF对丝状真菌的作用机制，主要是通过抑制真菌神经酞胺合成酶活性，改变细胞膜中的鞘脂类化合物的组成，最终导致靶标真菌菌丝的去极化[48]。目前，这些活性小分子物质结构基本都已被阐明。

此外，关于HSAF与WAP-8294A2生物合成关键调控基因的研究报道较多。其中留醇脱氢酶基因(Sterol desaturase，SD)是HSAF生物合成中的关键基因，SD基因催化3-deOH HSAF(3-dehydroxy HSAF)转化为HSAF,且铁氧化还原酶基因(Ferredoxin reductase，FNR)的参与能够明显增强SD基因的催化活性[49]。WAP-8294A2生物合成过程中需要酞基转移酶(Acyl-CoA ligase,ACL)激活3-OH脂肪酸链和酞基转移蛋白，且WAP-8294A2已进入临床Ⅰ期试验阶段[50]。

6.3 生物表面活性剂、抗生素

L.enzymogenes3.1T8、L.enzymogenC3分泌的生物表面活性剂，对由立枯丝核菌引起的肯塔基蓝草病害(PoapratensisL.)等具有显著的抑制效果，其作用机制是该活性剂能阻止真菌孢子游动及萌发，建立与细菌细胞之间的联系，克服细胞之间的疏水阻力，降低病原菌游动孢子的表面张力，在细胞膜内外膨压的作用下，使游动孢子细胞破裂而死亡[46]。该属的其他细菌如Lysobactersp.strain SB-K88和L.enzymogenes3.1T8能产生抗生素，抑制瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)与螺壳状丝囊霉(A.cochlioides)引起的猝倒病[51]。虽然这些抗生素的结构尚未得到完全解析，但初步的研究表明，这些抗生素的拮抗机理是使F-actin(肌动蛋白)断裂、游走孢子的超微结构破坏、细胞壁水解和包囊萌发受抑制等[44]。同时，有研究发现，L.enzymogenesOH11可以产生一种黄色素的抗生素使其菌落颜色呈黄色，这些黄色素通过Ⅱ型聚酮合酶(PKS)合成，是细菌赖以生存的遮光剂[52]。

此外，L.enzymogenesC3可以诱导宿主植物产生对镰刀菌引起的赤霉病的抗性，对根腐离蠕孢孢子的萌发和叶点病也有很好的防治作用[53]。最新的研究显示，L.enzymogenesC3有许多分泌物能引发动物和植物病原菌G+的三型分泌系统[26]，该系统参与调控L.enzymogenesC3在靶标真菌菌丝上的有效附着[54]，但其机制相对复杂，尚有待进一步阐明。虽然对该属少数细菌的抑菌机理已有初步了解，但大部分抑菌物质的代谢途径及其详细的抑菌机制仍不明确，还需深入研究。

7 溶杆菌属细菌对线虫的生物防治作用

线虫体壁主要由蛋白质、脂质和碳水化合物组成，卵壳主要由胶原质状的蛋白围绕脂蛋白所组成，而溶杆菌属大部分菌株能分泌几丁质酶和蛋白溶解酶，故溶杆菌属细菌对线虫引起的病害能起到高效的防治作用。L.enzymogenesOH11对南方根结线虫(M.incognita)的2龄幼虫及其卵化有强烈的抑制作用[46]。L.enzymogenesC3对爪哇根结线虫(M.javanica)的卵化无抑制作用，但对γ-辐照的卵能起到破坏作用，主要作用机制是细菌可以降解线虫卵壳的几丁质层[54]。最近的研究显示，L.enzymogenesC3和L.antibioticus能有效防治甜菜囊肿线虫(HeteroderaschachtiiSchmidt)引起的白菜囊肿和大豆囊肿线虫(Heteroderaglycines)引起的大豆囊肿，而且L.enzymogenesC3还可以杀死植物寄生的成年、幼年线虫及培养的线虫[23]。

8 溶杆菌属的生物安全性及应用前景

应用微生物菌剂进行生物防治之前必须经过严格的风险评估，应权衡其在农业生产中对环境危害的风险系数，以确定该生物菌剂对人体是否有害。溶杆菌属就是一个很好的例子，其在环境中有很高的丰度，且是自然种群，很难受到人为控制。因此，在使用溶杆菌属细菌进行生物防治之前，一定要先进行严格的风险评估[3]。

Christensen等[1]研究表明，溶杆菌属具有独特的滑动性和溶菌活性，这些属性使得溶杆菌属细菌在生物防治病原菌和线虫方面具有很强的优势。目前使用的对溶杆菌属细菌的详细介绍主要是2001年Christensen的描述。随着溶杆菌属新种不断被发现，对其描述需要大量修改，而且溶杆菌属细菌的一些特殊特征需要通过不同种之间的差异性进行分析，所以必须基于DNA的检测方法，结合选择性培养才能更深入地了解溶杆菌属细菌的形态特征、栖息地和多样性[27]。

溶杆菌属高效、广谱的拮抗作用具有诱人的应用前景，现已成为植物病害生防微生物的重要组成部分，但与解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等其他生防菌相比，其研究还处于起步阶段，对溶杆菌属相关抗菌物质及其抗菌机理尚不甚了解。近年来，现代生物学技术特别是分离纯化、波谱学等技术的突破，为溶杆菌属的进一步研究提供了强有力的技术手段。因此，今后应该从以下方面加强研究：首先，溶杆菌属细菌数量很多，已发现的数量相对较少，需深入发掘具有广谱抗菌性的新细菌，并在评价其安全性的基础上，研究其生防潜力、作用机制，发掘其具有巨大生防前景的活性分子。其次，需深入研究已发现的具有显著抗菌活性的小分子物质的抑菌机理。陕西师范大学药用植物资源与天然药物化学教育部重点实验室在远志根际分离得到1株菌株，经鉴定其为溶杆菌属细菌，并命名为L.yananisissp.nov.[27]；经研究发现，其胞外抗菌物质主要为蛋白类，在建立该菌胞外和胞内蛋白双向电泳图谱的基础上[55]，进一步分离得到了枯草杆菌蛋白酶、α水解蛋白酶和β水解蛋白酶3种具有抑菌活性的蛋白质，其抑菌效果更强的小肽类物质正在分离纯化中。同时研究还发现，L.yanansis细菌具有较好的定殖能力，能在玉米根部表皮和韧皮部定殖，这为L.yanansis细菌生物防治机理的研究和开发利用奠定了基础(相关结果另文发表)；此外，利用诱变育种、原生质融合及转化技术对菌株进行改良，以提高菌株的抑菌能力；加强细菌活性物质发酵条件的优化，使其规模化、产业化，从而推动其从实验室和温室的小规模研究向大田试验迈进。

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Advance in bacteria identification and biocontrol mechanism ofLysobacterspp.

WANG Na1,WU Kun-yi1,CUI Lang-jun1,ZHANG Hua-wei2

(1KeyLaboratoryofMedicinalPlantResourcesandNaturalPharmaceuticalChemistry(MinistryofEducation，SchoolofLifeSciences,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an，Shaanxi710062,China；2SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou,Zhejiang310014,China)

Widely attention has been paid toLysobacterspeciessince they can inhibit growth of pathogens.The distribution environment and typical biochemical characteristics of 26 reportedLysobacterspecies were analyzed and their phylogenetic tree was conducted based on 16S rDNA sequence similarity and fatty acid composition.DNA-DNA hybridization results were used as evidence.Then,the biological control of pathogenic bacteria and nematodes ofLysobacterspecies were discussed and the biosafety and application for biological control were introduced.

Lysobacter;bacteria identification;DNA-DNA hybridization;biological control

2013-12-13

国家自然科学基金项目(31101481)；中央高校基本科研业务费项目(GK261001237)

王 娜(1989-)，女，陕西宝鸡人，硕士，主要从事药用植物内生菌的开发与利用研究。E-mail：shxwangna@163.com

崔浪军(1977-)，男，陕西神木人，副教授，硕士生导师，主要从事药用植物内生菌的开发与利用研究。 E-mail：ljcui@snnu.edu.cn

时间:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.010

Q93-331

A

1671-9387(2015)05-0174-09

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.010.html