响应面法优化大孔树脂纯化百合多糖研究

2015-02-20廖琴潘智全佘高照张春向士全张朝晖

当代化工研究 2015年3期

廖琴潘智全佘高照张春向士全张朝晖

( 1．吉首大学化学化工学院湖南吉首 416000 2．湖南省龙山县现代中药材开发有限公司湖南龙山 416800)

百合是百合科百合属多年生草本球根植物，又名山丹、重迈、中庭、摩罗、重箱、中逢花、百合蒜、大师傅蒜、蒜脑薯、夜合花等，其干制品为肉质鳞叶，多为药用，具有养阴润肺、清心安神等功效[1]。研究表明百合多糖的水溶液对细胞免疫功能有一定增强作用[2]。苗明三等研究表明百合多糖具有较好的免疫兴奋作用和抗氧化、抗衰老作用[3]。王璋等研究发现百合水溶性多糖能抑制肺癌细胞和黑色素[4]。百合多糖的制备方法一般包括预处理、分离和纯化三个阶段。其中纯化是关键，其目的是将粗多糖中的杂质去除而获得较纯净的多糖组分。目前已报道的纯化多糖的方法有离子交换树脂法[5]、有机膜超滤法[6]、分级沉淀法[7]、离心沉淀色谱法[8]、凝胶层析法[9]、陶瓷膜超滤技术[10]等。其中离子交换树脂法具有操作简单，对产品无污染，费用低等优点。湖南龙山地区百合产量大、质量高，但目前对此地区的百合缺乏深入研究。本文以武陵山区中药材生产基地-龙山百合为原料，使用五种树脂对百合多糖提取液中的多糖纯化效果进行探讨，并采用响应面法对大孔树脂纯化百合多糖的纯化工艺进行优化研究，为湖南龙山地区百合产品深入开发利用奠定基础。

一、实验部分

1.实验仪器和药品

（1）实验仪器 JA2003N 型电子天平 (上海精密仪器厂）；UV-2450 型紫外分光光度计（日本岛津公司）；KQ-250E 型超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；DGG-9053A 电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司）。层析柱（3cm ×30cm）；D101、D315、AB-8、717 阴离子交换树脂、ADS-7 树脂。

（2）实验药品百合，龙山县现代中药材开发有限公司提供（生产批号：1204003）；苯酚、盐酸、浓硫酸、95%乙醇、氢氧化钠，购自湖南长沙化学试剂有限公司；葡萄糖标准品，江苏药物研究所提供；蒸馏水；以上试剂均为分析纯。

2.试验方法

（1）百合粗多糖的制备参照文献[11]所述，称取过20 目筛的百合颗粒料液比为1:20，提取温度为70℃，此条件下超声波辅助提取45min。过滤得到百合多糖提取液备用。

（2）纯化过程百合片→超声波提取→百合粗多糖溶液→上沉析柱→纯多糖溶液→醇沉过夜→纯多糖→多糖含量测定

（3）百合多糖纯化产率和多糖含量测定

①标准曲线的绘制参考文献[12]，精确称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖200mg，先加少量蒸馏水溶解后移至1000mL 量瓶中，定容至刻度，摇匀，配制葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL，分别置于10mL 试管中，加水使各溶液的体积为2.0mL，然后加入1.0mL 苯酚溶液，摇匀，快速加入浓硫酸5.0mL，摇匀后放入冷水中冷却5min，用2.0mL 蒸馏水做空白，用分光光度计在波长490nm 处测定吸光度，将上述数据进行线性回归，得标准曲线方程:

式中：C 为标准溶液浓度（mg/mL）；A 为吸光度。

②多糖含量与产率的计算本文采用苯酚-硫酸法[13]测定多糖含量，称取纯多糖样品溶于100mL 蒸馏水中，精密吸取样品溶液2.5mL 置于100mL 容量瓶中，并加水稀释定容。然后精密量取2.0mL 于试管中，加入1.0mL5%的苯酚溶液，摇匀，快速加入浓硫酸5.0mL，摇匀后放入冷水中冷却5min，用2.0mL 蒸馏水做空白，用分光光度计在波长490nm 处测定吸光度。多糖提取率计算公式如下:

（4）树脂预处理用5%盐酸浸泡树脂24h，然后用蒸馏水洗至中性；再用5% NaOH 溶液浸泡树脂24h，洗至中性，浸泡于蒸馏水中备用。树脂装柱采用湿法装柱。

二、结果与讨论

1.树脂的纯化效果筛选实验

分别称取50gD315、AB-8、D101、717 阴离子交换树脂、ADS-7 五种已处理好的树脂在室温下对2mg/mL，pH 值为6 的百合粗多糖溶液进行吸附实验，调节层析柱流速为2mL/min，收集流出液，浓缩后用95%乙醇醇沉过夜，过滤得纯化的百合多糖。将百合多糖干燥称量，采用苯酚-硫酸法检测其含量，得到五种树脂纯化结果如表1 所示。

由表1 可知D315 大孔树脂纯化百合多糖的效果明显高于其他四种树脂，所得多糖含量为81.92 1.72%，纯化产率67.13 3.04%，在百合多糖的纯化中具有明显优势，所以本实验选取D315 大孔树脂对百合多糖进行纯化工艺研究。

2.D315 大孔树脂纯化工艺单因素实验结果

将百合粗多糖溶液上预装D315大孔树脂的层析柱，收集流出液，浓缩后用95%乙醇醇沉过夜。过滤得经纯化的百合多糖，将百合多糖干燥称量。

（1）层析柱流速对百合多糖纯化影响

图1 层析柱流速对百合多糖纯化影响Figure 1 Effect of the flow rate of the columns on the purification of polysaccharide

表1 五种树脂对百合多糖纯化效果Table 1 The purification results of Lilium Brownii polysaccharide with five resins

将2mg/mL 的百合粗多糖溶液调节溶液pH=6，在20℃下上层析柱，研究1mL/min、2mL/min、3mL/min、4mL/min 等不同流速对百合多糖纯化的影响。实验结果如图1 所示。当层析柱流速为2mL/min 时，纯化后的多糖含量最高；随着流速增加，产率逐渐增加，流速为4mL/min 时纯化产率最高。

（2）粗多糖浓度对百合多糖纯化影响

调节粗多糖溶液pH 值为6，温度为20℃，控制粗多糖溶液通过层析柱的流速为2mL/min，研究1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL 等不同浓度的粗多糖溶液对百合多糖纯化效果的影响。结果如图2 所示，当粗多糖的浓度为2mg/mL，经纯化后的产品中多糖含量最高；而纯化产量随浓度增加而增大。

图2 粗多糖浓度对百合多糖纯化影响Figure 2 Effect of the concentration of raw sugar on the purification of polysaccharide

（3）粗多糖溶液pH 值对百合多糖纯化影响

Figure 3 Effect of raw sugar solution pH on the purification of polysaccharide

选用2mg/mL 的粗多糖溶液，控制上柱温度为20℃，调节层析柱流速为2mL/min，研究粗糖溶液不同pH 值分别为5、6、7、8 对百合多糖纯化的影响。实验结果如图3 所示。由图3 可知，粗多糖溶液pH 为7 时纯化产品多糖含量最高，多糖含量为89.73%。粗多糖溶液pH 为6 时纯化产率最高，为87.55%。

（4）上柱温度对百合多糖纯化影响

浓度为2mg/mL，pH 值为6 的百合粗多糖溶液在层析柱流速为2mL/min 下研究20℃、40℃、60℃、80℃等不同上柱温度对百合多糖纯化的影响，实验结果如图4 所示。由图4 可知，粗多糖溶液上柱温度越高，产品中的多糖含量越高，上柱温度80℃时，产品多糖含量为88.02%。上柱温度低于60℃时，纯化产率随温度升高而增加，上柱温度高于60℃，纯化产率随温度升高而下降，上柱温度为60℃，纯化产率最大79.10%。

图4 上柱温度对百合多糖纯化影响Figure 4 Effect of column temperature on the purification of polysaccharide

图3 粗多糖溶液pH 值对百合多糖纯化影响

3.响应面优化实验

（1）数据分析根据Box.Benhnken 的中心组合实验设计原理[14,15]，综合单因素实验影响结果，选取层析柱流速、粗多糖浓度、上柱温度和粗多糖溶液pH 值对百合多糖提取率影响的四个因素，如表2 所示，在单因素实验的基础上采用四因素三水平响应面分析方法，响应面分析方案及实验结果见表3。

模型的建立及显著件检验：利用Design-Expert. V8软件对上表中数据进行二次线性回归拟合和显著性分析，分析结果见表4 和表5，回归拟合数学模型为：

表2 响应面分析实验因素与水平Table 2 Factors and levers of response surface test

多糖含量=87.98 + 1.30A + 0.50B + 2.13C + 0.75D - 0.40AB + 2.34AC - 1.40AD + 2.24BC + 0.72BD - 0.19CD - 1.88A2- 2.87 B2- 0.60 C2- 7.72 D2

纯化产率=73.85 - 2.52A + 5.46B - 2.26C - 3.28D - 1.73AB + 3.84AC - 0.76AD - 0.52BC + 7.39BD + 4.58CD - 0.84A2- 2.51 B2- 5.73C2- 2.16D2

表3 响应面分析实验方案及实验结果Table 3 Test design and results of response surface analysis

（2）多糖含量回归方程的方差分析结果

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表4 多糖含量回归方程的方差分析结果Table 4 Estimate value of partial regression coefficient of polysaccharide content regress equation

由表4 可知，层析柱流速与上柱温度的交互项、粗多糖浓度与上柱温度的交互项对多糖含量影响显著。层析柱流速的二次项、粗多糖浓度的二次项与粗多糖浓度的二次项对多糖含量影响显著。该模型R=0.938，R 值越接近1，拟合度越高，表明该模型对实验的拟合较好。由上表得出多糖含量的影响因素顺序为：上柱温度＞层析柱流速＞粗多糖溶液pH 值＞粗多糖浓度。

（3）纯化产率回归方程的方差分析结果

由表5 可知，粗多糖浓度与粗多糖溶液pH 值的交互项对纯化产率影响显著。上柱温度的二次项对纯化产率影响显著。由上表得出纯化产率的影响因素顺序为：粗多糖浓度＞粗多糖溶液pH值＞层析柱流速＞上柱温度。

（4）百合多糖纯化的响应面分析

D315 大孔树脂纯化百合多糖工艺，用Design- Expert.V8 软件进行响应面分析，得到响应曲面图。

① 百合多糖纯化产品多糖含量的响应面分析

响应面优化实验结果表明最优条件为：层析柱流速为3.04mL/min，粗糖浓度为3.57mg/mL，上柱温度为46.06℃，粗糖溶液pH 值为7.13。结合实际操作，该纯化工艺最佳工艺优化为层析柱流速3mL/min，粗糖浓度3.6mg/mL，上柱温度46℃，粗糖溶液pH 值为7。

4.实验结果验证

精确称取百合粗多糖，按最优纯化工艺条件配成浓度为3.6mg/mL，调pH 为7，加热到 46℃，上柱流速为3mL/min 的层析柱，做5 组平行试验，采用苯酚-硫酸法测定产品中多糖含量。结果表明纯化平均产率为75.57 2.60%，产品中平均多糖含量为89.62 4.44%。

表5 纯化产率回归方程的方差分析结果Table 5 Estimate value of partial regression coefficient of purification yield regress equation

5.对粗多糖溶液两次纯化试验

按最优纯化工艺条件将百合粗多糖溶液配成浓度为3.6mg/mL，调pH 为7，加热到46℃，上柱流速为3mL/min 的层析柱。将得到的经一次纯化的多糖溶液再次在最优纯化工艺条件下纯化。进行3 组平行试验，采用苯酚-硫酸法测定产品中多糖含量。结果表明纯化两次后多糖含量平均值为92.17 1.64%，相比一次纯化的多糖含量89.62 4.44%提高的并不多；纯化两次后纯化产率平均值为68.12 2.98%，相比一次纯化的纯化产率75.57 2.60%，二次纯化后产率下降了7.45%。这表明使用D315 大孔树脂对百合粗多糖溶液进行纯化只需进行一次纯化就行，两次纯化会很大程度上降低产品产量。

6.D315 大孔树脂使用寿命试验

在最优纯化工艺条件下，将粗多糖溶液上柱预装50gD315 大孔树脂的层析柱，探讨50gD315 大孔树脂分别处理100～800mL 粗多糖溶液的纯化效果，以100mL 为梯度进行试验。试验结果如图5。

由图5 可知，50gD315 大孔树脂处理600mL 粗多糖溶液后，产品中的多糖含量将会下降，而纯化产率一直呈上升趋势，这是因为大孔树脂对杂质的吸附能力越来越弱，纯化产品中杂质含量逐渐升高，所以产率一直升高，并且导致产品中多糖含量下降。所以50g的D315 大孔树脂最佳处理量在500～600mL 粗多糖溶液。

三、结论

结合单因素实验和响应面分析法，综合多糖纯度和得率两个指标，优化出D315 大孔树脂纯化百合多糖最佳工艺条件为层析柱流速3mL/min，粗多糖浓度3.6mg/mL，上柱温度46℃，粗糖溶液pH 值为7。在此工艺条件下，产品中多糖平均含量为89.62%，平均纯化产率为75.57%。在最优工艺条件下只需要上柱纯化一次，50gD315 大孔树脂使一次性能处理500～600 mL浓度为3.6g/mL 的粗多糖溶液，效果最佳。