miR-200c对舌癌Tca8113细胞增殖和凋亡的影响*

朱名毅，姚金光，刘 津，姜 艳△

(1.右江民族医学院科学实验中心，广西百色 533000；2.右江民族医学院附属医院，广西百色 533000)



miR-200c对舌癌Tca8113细胞增殖和凋亡的影响*

朱名毅1，姚金光2，刘 津2，姜 艳1△

(1.右江民族医学院科学实验中心，广西百色 533000；2.右江民族医学院附属医院，广西百色 533000)

目的 探讨miR-200c对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖和凋亡的影响。方法 将miR-200c的模拟物通过脂质体转染到人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞内，通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖能力、流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率、Westernblot检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和Bcl-2蛋白的表达。结果 与对照组相比，miR-200c模拟物20、40、80nmol/L组的Tca8113细胞生长受到明显抑制，差异有统计学意义(P<0.05)，miR-200c模拟物的浓度越大，作用时间越长，抑制效果越明显(P<0.05)；转染miR-200c模拟物48h后，Tca8113细胞停滞于G0/G1期，细胞凋亡率显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；Westernblot证明20、40、80nmol/L组Bcl-2蛋白表达量明显低于对照组，而Caspase-3蛋白表达量明显高于对照组(P<0.05)。结论miR-200c过表达可抑制舌癌Tca8113细胞增殖并诱导细胞凋亡。

舌肿瘤；miR-200c；细胞增殖；细胞凋亡

微RNA(microRNA，miRNA)是近年来发现的一类由18-25个短寡核苷酸组成的内源性非编码单链小分子RNA。miRNA广泛存在于各种生物中，参与细胞的发育、分化、增殖、凋亡、迁移等多种生物学过程[1]。miRNA可作为癌基因或抑癌基因，与许多肿瘤的发生、发展密切相关，目前的研究发现舌鳞癌中存在 miRNA 差异性表达，改变某些特异 miRNA 的表达水平，可影响舌癌的发生、发展[2-3]。miR-200c具有调节下游靶基因表达的作用，在肿瘤中miR-200c主要通过调控转录因子的表达参与肿瘤转移的上皮间质转化过程[4-6]。很少有文献报道miR-200c在肿瘤细胞增殖、凋亡过程中的作用及其机制。本文通过体外将miR-200c模拟物转染入舌癌细胞，上调 miR-200c的表达，观察其对舌癌细胞增殖、凋亡的影响，并检测Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的变化，分析其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株由广西医科大学邝晓聪教师赠送。miRNA模拟物及其阴性对照由上海吉玛制药技术有限公司合成，miR-200c模拟物序列：5′-UAA UAC UGC CGG GUA AUG AUG GA-3′；miR-200c模拟物阴性对照序列：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′；miRNA inhibitor negative control-FAM序列：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′。RPMI 1640培养液和胎牛血清购自美国HYCLONE公司。Opti-MEMⅠ培养液和LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司。四甲基偶氮唑盐(MTT) 和细胞周期检测试剂盒购自美国sigma公司，细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司，二甲基亚砜(DMSO)购自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和瞬时转染 将舌鳞癌细胞株Tca8113复苏后，接种于25 cm2培养瓶中，加入含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液，置于培养箱中(37 ℃、5%CO2)常规培养，选择对数生长期细胞用于实验。转染前1 d，选择生长状态良好的Tca8113细胞，用100 μL无抗生素RPMI 1640培养液按3×103每孔的浓度接种到96孔板，24 h后细胞浓度为50%～70%时进行转染实验。其具体步骤为：先用12.50 μL Opti-MEM Ⅰ稀释miRNA模拟物；再将0.25 μL Lipofectamine 2000加入到12.50 μL Opti-MEM Ⅰ中，室温静止5 min；然后把二者混匀，室温放置20 min；最后把混合液全部均匀加入到96孔板中，继续培养4 h后换成含血清和抗生素的RPMI 1640培养液进行后续实验。将羧基荧光素(caboxyfluorescein，FAM)标记的miR-200c阴性对照转染到Tca8113细胞中，细胞常规培养24 h后，在荧光显微镜下观察转染效率。

1.2.2 MTT法检测miR-200c对Tca8113细胞增殖的影响 为了解miR-200c模拟物(mimics)、转染试剂以及背景效应之间的差异，以排除非序列特异性的效应，本研究在预实验中设计了3组对照：(1)空白对照组(A组)；(2)脂质体试剂对照组(B组)；(3)miR-200c模拟物阴性对照组(C组)。Tca8113细胞接种于96孔板后，在同样的实验条件下，先观察以上3组细胞之间生长情况，证实它们对细胞的生长没有明显影响，后续的实验中均以B组作为对照组。实验组分为20、40、80 nmol/L组，按上述转染方法分别将终浓度为20、40、80 nmol/L的miR-200c模拟物转染Tca8113细胞，常规孵育24、48、72 h后，弃培养液，每孔加入质量浓度5 g/L的MTT溶液20 μL继续培养4 h后，洗净该盐，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。每组细胞设5个平行孔，重复3次实验。用酶标仪测量各孔的吸光度值(A值)，以细胞增殖率反映细胞增殖情况，细胞增殖率=转染细胞A值/对照细胞A值×100%。

1.2.3 流式细胞术检测miR-200c对细胞周期的影响 Tca8113细胞转染miR-200c模拟物48 h后，对常规胰酶消化、离心收集转染后的细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，之后加入2倍体积的预冷70%乙醇于4 ℃固定过夜，第2天PBS洗涤2次后，加500 μL PBS(含100 μg/mL RNaseA，50 g/mL溴化乙锭)，于4 ℃避光孵育30 min，200目筛网过滤后上机检测细胞周期，实验重复3次，取平均值。

1.2.4 流式细胞术检测miR-200c对细胞凋亡的影响 Tca8113细胞转染miR-200c模拟物48 h后，以适量胰酶消化，离心收集转染后的细胞，用PBS洗涤细胞2次，用500 μL Binding Buffer调整细胞浓度为(1～5)×105个/mL，向重悬液中加入5 μL Annexin V-FITC 染色，随后加入5 μL碘化丙啶(PI)染色，室温下避光孵育 15 min，流式细胞仪检测凋亡率，实验重复 3 次。

1.2.5 Western blot检测miR-200c对细胞Bcl-2和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)蛋白表达的影响 Tca8113细胞转染miR-200c模拟物48 h后，常规胰酶消化，离心收集转染后的细胞，加入适量含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的细胞裂解液于冰上裂解细胞，提取总蛋白，用蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量。15%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。37 ℃下用10%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入Bcl-2、Caspase-3抗体，4 ℃冰箱过夜孵育，洗膜后加入二抗，室温孵育2 h，洗膜后加入增强化学发光(ECL)试剂曝光、显影，以β-actin为内参。将胶片扫描后，用Image Pro PLUS 7.0软件分析Bcl-2、Caspase-3和β-actin的灰度值，以目的蛋白与内参照β-actin的比值为目的蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1miR-200c转染效率的观察FAM标记的miR-200c阴性对照转染Tca8113细胞24h后，在荧光显微镜下观察，发现大部分细胞均含有荧光，转染效率可达到90%以上。

2.2miR-200c对Tca8113细胞增殖的影响Tca8113细胞经转染miRNA-200c模拟物后，细胞增殖比未转染的细胞明显减缓。转染24h时，40、80nmol/L组miRNA-200c模拟物对细胞生长抑制与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；转染48、72h时，3组不同浓度miRNA-200c模拟物对细胞生长抑制与对照组比较，均差异有统计学意义(P<0.05)，miRNA-200c模拟物的浓度越大，其抑制效果越明显，见图1。

a：P<0.05，与对照组比较。

图1miR-200c对Tca8113细胞增殖的影响

2.3 流式细胞术检测miR-200c对细胞周期和凋亡的影响 与对照组比较，实验组miR-200c模拟物可以使G0/G1期细胞比例增加、S期细胞比例减少，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-200c模拟物还可以使细胞的凋亡率明显增加，且miR-200c模拟物浓度越大，凋亡率越高(P<0.05)，见表1。

表1 各组细胞周期和凋亡情况比较

a：P<0.05，与对照组比较。

2.4miR-200c对Tca8113细胞Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响 以对照组组目的蛋白/β-actin的比值为1，Westernblot法检测结果显示，转染miR-200c模拟物48h后，随着miR-200c模拟物浓度增加，20、40、80nmol/L组细胞Bcl-2蛋白相对表达量递减，细胞Caspase-3蛋白相对表达量递增，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组细胞Bcl-2和Caspase-3蛋白表达比较

a：P<0.05，与对照组比较。

3 讨 论

研究表明舌癌具有独特的miRNA表达谱，miRNA的表达改变在舌癌的发生、发展中发挥着重要的作用。李莎莎等[7]学者采用RT-qPCR和原位杂交法检测发现miR-21在舌鳞癌细胞及组织标本中都呈高表达；舌鳞癌分化程度越低，miR-21表达越高；miR-21表达与患者生存期呈负关；miR-21高表达患者的预后较低表达者差。Jia等[8]学者认为miR-195的低表达与舌鳞癌大小和临床分期有关，同时miR-195的低表达还能降低患者的生存时间；增加miR-195在舌癌细胞SCC-15和CAL27中的表达，可以抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，与降低周期素D1(CyclinD1)和Bcl-2的表达有关。miR-200c是miR-200家族成员之一，近年来许多研究表明，miR-200c在头颈部肿瘤、乳腺癌、胰腺癌、肾癌膀胱癌和肝癌等肿瘤中呈低表达[9]。miR-200c参与肿瘤发生、发展、转移和耐药等过程，miR-200c在肺癌患者血清中呈低表达，高表达miR-200c会降低肺癌患者的生存时间；miR-200c也能通过靶向作用蛋白锌指E盒结合同源盒蛋白1/2(ZEB1/2)，上调E-钙黏蛋白的表达，从而抑制肿瘤转移过程中的上皮间质转化过程；此外miR-200c不但能提高肿瘤细胞对药物的敏感性，也能增加肿瘤细胞对化疗药物的耐药性[10]。王晟[11]发现miR-200c在高度恶性乳腺癌细胞株和乳腺癌标本中呈低表达，过表达乳腺癌细胞株的miR-200c，可以下调G13信号通路、突触传递信号通路、神经冲动传递信号通路和细胞内代谢负调控信号通路等基因的表达，还发现内皮素受体A(EDNRA)可能是miR-200c的调控靶点。本研究通过MTT实验检测发现舌癌Tca8113细胞转染miR-200c模拟物，上调miR-200c的表达，可抑制细胞的增殖；miR-200c模拟物浓度越大，对细胞增殖的抑制率越高。流式细胞术结果显示，miR-200c能够使G0/G1期细胞增多，而S期细胞减少，从而抑制舌癌细胞的生长。

Bcl-2家族的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一，bcl-2基因家族包括促进凋亡基因如bax等和抑制凋亡的基因如bcl-2等，过表达bcl-2或下调bax可抑制肿瘤细胞凋亡[12-13]。细胞凋亡的过程也就是Caspase酶被激活，引起“瀑布式”级联反应，对底物进行切割，降解DNA修复酶，使染色体、细胞骨架和核蛋白等裂解成小片段，最终导致细胞死亡[14]。Bcl-2能够通过抑制细胞色素C的释放，从而阻断Caspase断裂重要的细胞内基质，细胞凋亡信号逐级放大，激活的Caspase-3介导细胞死亡[15]。本研究还发现，miR-200c模拟物转染舌癌Tca8113细胞后，细胞凋亡率显著增加，而且与miR-200c模拟物浓度呈正相关。Western-blot结果显示Bcl-2蛋白表达水平下降，而Caspase-3蛋白表达水平增高，说明上调Tca8113细胞中miR-200c的表达，可以降低Bcl-2的表达，从而激活Caspase-3酶的活性，促进细胞凋亡。

综上所述，上调舌癌细胞中miR-200c的表达后，Tca8113细胞增殖水平明显受到抑制，流式细胞术检测显示G0/G1期细胞增加，细胞凋亡率也明显增加，Western-blot结果显示细胞Bcl-2蛋白表达水平降低，Caspase-3活化增强。本实验初步证明miR-200c可以作为舌癌的一种抑癌基因，能够降低与抗凋亡相关基因Bcl-2的表达，通过激活Caspase-3的活化从而抑制舌癌细胞增殖促进其凋亡。针对miR-200c的治疗策略可能会给舌癌的治疗提供新的思路和治疗靶点。

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Effects of miR-200c on proliferation and apoptosis of tongue carcinoma Tca8113 cells*

ZhuMingyi1,YaoJinguang2,LiuJin2,JiangYan1△

(1.MedicalScientificExperimentalCenter,YoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise,Guangxi533000,China;2.AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise,Guangxi533000,China)

Objective To investigate the effects of miR-200c on proliferation and apoptosis of tongue squamous cell carcinoma (TCCS) Tca8113 cells.Methods The mimics of miR-200c were transfected into Tca8113 cells using liposome.The Tca8113 cell proliferation was detected by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay.The flow cytometry assay was used to determine the cell cycle and the apoptosis rate of Tca8113 cell.The protein expression levels of Bcl-2 and Caspase-3 in Tca8113 cell was detected by Western-blot.Results The 20,40,80 nmol/L miR-200c mimics groups inhibited the growth of Tca8113 cells,the difference compared with the control group showing statistical significance(P<0.05).The greater the miR-200c mimics concentration and the longer duration of action,the more significant the inhibition effect(P<0.05).After 48h transfecting by miR-200c mimics,the Tca8113 cells were arrested in the G0/G1phases of cell cycle,and the apoptosis rate of the miR-200c mimics groups was significantly increased,the difference compared with the control group showing statistical significance(P<0.05);Western blot verified that the expression amount of Bcl-2 protein in the 20,40,80 nmol/L miR-200c groups was significantly lower than that in the control group,while the expression amount of Caspase-3 protein was significantly higher than that in the control group(P<0.05).Conclusion The overexpression of miR-200c might inhibit the proliferation of Tca8113 cell and induces their apoptosis.

tongue neoplasms;miR-200c;cell proliferation;apoptosis

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.009

广西高等学校科研资助项目(201204LX329)；右江民族医学院科研资助项目[右医科字(2011)1号]。 作者简介：朱名毅(1982-)，讲师，硕士研究生，主要从事肿瘤分子生物学研究。△

，Tel：(0776)2837119；E-mail：jiangyan19852005@126.com。

R

A

1671-8348(2015)10-1322-03

2014-10-30

2014-12-18)