人乳头状瘤病毒检测方法研究进展

人乳头状瘤病毒检测方法研究进展

张媛媛综述古扎丽努尔·阿不力孜审校

(新疆医科大学附属肿瘤医院妇外五科， 乌鲁木齐830011)

摘要:人乳头状瘤病毒(Humanpapilloma virus， HPV)的持续感染是宫颈癌发生和发展的重要条件。HPV的检测对宫颈癌及癌前病变的早期诊断、治疗后随访具有重要意义。本文就HPV检测方法研究进展作一综述。

关键词:宫颈癌； 人乳头瘤病毒； 检测方法； 杂交捕获二代； 实时聚合酶链反应； Cervista HPV HR 检测法

中图分类号：R446.5文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.04.006

[收稿日期：2014-11-23]

基金项目：国家自然科学基金(81460752)

作者简介：屈亚琴(1988-)，女(回族)，在读硕士，研究方向：维中西医结合研究卵巢早衰。

宫颈癌是对女性健康造成严重危害的恶性肿瘤,其发病率位于全球女性恶性肿瘤第二位,全世界每年的新发病例约为50万人,死亡人数约27万，发展中国家占统计数据中的80%[1]。很多文献报道， 在宫颈上皮内瘤变( CIN) I中人乳头状瘤病毒(humanpapilloma virus， HPV)的感染率为70%～78%， 在CINⅡ～ Ⅲ中为80%～89% ，在宫颈癌中则超过95%[ 2]。目前被公认的宫颈病变主要危险因素为持续感染高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)，宫颈癌明确的致病因素和缓慢的发病过程为普查普治提供了宝贵时机[3-5]。 HR-HPV的检测成为防治宫颈癌的一个重要环节，很多发达国家已经将HPV DNA 检测列为宫颈癌筛查的必检项目[ 6]。HPV DNA检测方法可分为定量检测和定性检测2种。目前，2种HPV检测法根据临床需要用于宫颈癌的筛查、随诊、预后评估。本文就 HPV检测方法的研究进展相关内容进行综述。

1细胞学检测及血清学检测

细胞学检测简单易行，但灵敏度不高，主要由于巴氏涂片的取材、制片及阅片者的主观因素影响。免疫组化法主要检测的是 HPV 抗原，其原理是通过抗 L1蛋白抗体与对应的 HPV 外壳蛋白反应来检测 HPV。虽然免疫组织化学法对于诊断 HPV 感染有很强的说服力，操作简单，能准确定位，但是仍存在假阴性较高及灵敏度较低等缺点，且不便于对 HPV进行分型， 因而目前应用较少。

2聚合酶链反应(PCR)

2.1实时荧光定量核酸扩增检测法(FQ -PCR )PCR可扩增靶序列至少100万倍,为HPV检测最敏感的技术。FQ- PCR 是 1995 年由美国 Perkin Flmer 公司研制成功的一种新型核酸定量检测方法。实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。由于荧光探针的引入, 而且被释放的荧光基团数目与 PCR 产物数量相同, 常用的 PCR 扩增仪与传统 PCR 扩增仪相比, 具有应用更广泛、定量测量、检测效率明显提高、扩增产物无需电泳分析、无管道内污染及结果重复性好等特点，因此该方法对 DNA 模板定量的准确性与特异性都有很大提高。 相对于传统电泳法，FQ -PCR检测可以一次同时检测多种 HPV 亚型的 DNA。在国内，常见的高危 HPV 亚型为 HPV16、 18、 31、 33、35、45 、52、 53、 56、 58亚型，高危型HPV感染需要引起高度重视，严密随访或进一步处理。由于该方法取材后易保存，无需另外添置杂交仪和基因芯片阅读仪，因此对于大规模的宫颈癌筛查是适用的。

2.2巢式PCR巢式PCR也是一种聚合酶链反应(PCR)，但其为变异的PCR，较传统的PCR反应只是用1对PCR引物(与巢式PCR的第1对PCR引物扩增片段相似)，巢式PCR使用2对引物。第2对引物又叫巢式引物，第2次PCR扩增片段短于第1次扩增，这是由于PCR扩增片段在第1次PCR扩增片段的内部，结合在第1次PCR产物内部。因此巢式PCR的扩增特异性很强。如果第1次扩增产生了错误片断，第2次扩增的概率很低。它的优点还有克服了单次扩增的“平台期效应”，扩增倍数的提高大大增加了PCR的灵敏度；第1次扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第2次扩增。从而提高反应的特异性，保证整个反应的准确性及可行性。

3杂交俘获试验

3.1基因捕获DNA检测法(hybridca Pture DNA test，HC2)HC2是最早通过美国FDA批准可在临床使用的HPV DNA检测方法， 在国内发达地区也被广泛用于临床HPV的检测及宫颈癌及宫颈癌前病变的筛查[7-8]。HC2本质上是利用分子杂交化学发光使信号放大的原理，属于线性级数放大 。

该方法采用半自动检测方式，利用 RNA 探针与对应基因进行杂交,形成 RNA-DNA混合物被标记有特异性单克隆抗体的微孔板捕获,通过加入底物进行化学发光比色,光的强弱对应于标记物碱性磷酸酶含量的高低,从而确定待测的 HPV DNA的含量[9]。德国一项纳入8 466 例患者的研究发现， HC2检测 CIN Ⅱ级的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为97.8%、95.3%、10.9%和 100%，而常规细胞学检测 CIN Ⅱ级的灵敏度仅为43.5%[10]。但其有局限性，可能存在病毒感染水平很低或者采样不正确导致的假阴性；易产生交叉污染，实验中还存在高危型探针可与低危型探针发生交叉反应、成本较高、操作复杂、耗时长等不足[11]。

3.2Cervista HPV HR 检测法Cervista HPV HR 是一种由美国FDA 批准的、定性的体外诊断检测方法，其采用Invader(Hologic 公司)—— 一种用于检测特定核苷酸序列的信号放大方法来检测DNA 的14种高危型HPV 病毒。2009 年3 月，Cervista(豪洛捷，贝德福德，MA)高危型HPV DNA 检测及Cervista HPV 16/18 型检测获得了美国FDA 的认证，Cervista HR HPV DNA 检测及Cervista HPV16/18 分型检测仅可用于采用特定器械及反应试剂收集的宫颈细胞学标本。Cervista HR HPV DNA 检测不仅可以检测与HC2 检测相同的13 种高危型HPV，还可以检测2009 年国际癌症研究署最新确认的HPV66 型。HPV66型在全球的感染率约为0.4%，不同地区之间存在差异，在HPV66 型阳性人群中CIN2的检出率为0.5%[12]。Cervista检测技术将高危型HPV 分为3个组，分别为A5/A6 组(包括HPV51、56、66 亚型)、A7 组(包括HPV18、39、45、59、68亚型)和A9 组(包括HPV16、31、33、35、52、58亚型)。Kjar等[13]研究发现感染A9 组HPV 的阳性率为22.7%，而感染A5/A6 组和A7 组HPV 的阳性率分别为2.9%和1.5%。CIN病变中最常见的HPV 亚型为16、58、31/33和35/36型，因此感染A9组HPV 的女性患CIN 病变的风险更高。

Cervista HPV HR 检测法采用唯一通过FDA 认证的拥有内部质控技术的产品可避免因样本量不足引起的假阴性，并且可以确认是否存在反应抑制物，从而确保阴性结果的准确性，不与低危型HPV 发生交叉反应，减少假阳性结果。同时检测HPV 的L1、E6/7 区，避免其他方法仅检测L1 区造成的假阴性，其特异性明显提高。Kham等[14]比较了50 000例样本的Cervista 及HC2检测结果，发现HC2 无内部质控机制，而Cervista 检测(内部质控)有1.1%的样本提示样本量不足，因此由于Cervista 检测技术存在内部质控机制，可以避免因样本量不足引起的假阴性。

Cervista 检测技术的另一优点是所需的细胞保存液量仅为HC2 的一半。Wright 等[15]对1 347例有细胞学、高危型HPV检测、阴道镜及组织病理活检资料的女性进行Cervista HR HPV DNA 检测及Cervista HPV 16/18 型检测。研究发现在细胞学AS-CUS女性中，高危型HPV 对CINⅡ及以上的敏感性为92.8%，阴性预测值为99.1%；对CINⅢ及宫颈癌的敏感性和阴性预测值均为100%；对CINⅡ及以上和CINⅢ或宫颈癌的特异性分别为44.2%及43%。结果表明，对细胞学AS-CUS 的女性，Cervista HR-HPV DNA 检测可以联合细胞学检查用于宫颈癌的筛查。

4基因芯片技术

基因芯片(genechip)也称为DNA芯片，Digene 公司在杂交捕获法的基础上结合基因芯片推出了HC Express Array 技术。其原理是采用原位合成或显微点样技术将许多的DNA探针固化于支持物表面上,产生二维DNA探针阵列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现快速、并行、高效的检测。由于该技术具有快速分型和定量的特点，因此可为临床提供更多的诊断依据和参考价值.

基因芯片法克服了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、通量低的缺点，可对大量标本进行一次性HPV检测，并提高了灵敏度和特异度，与荧光定量 PCR相比阳性率高出 6.45%[16]。随着基因芯片技术的发展，目前可检测 20 多种基因分型的芯片[17]。相对于杂交捕获法，基因芯片技术不但能对HPV进行分型检测，还可同时监测多个型别的混合感染，并对 HPV 疫苗的研制提供科学依据。但其也有一定的局限性，操作相对复杂，价格昂贵，因此对于大规模的宫颈癌筛查很难实现。在操作过程中也需要严格的质量控制，尽量降低由于PCR产物污染造成的假阳性。

综上所述，目前已证实高危型HPV感染是宫颈癌的主要致病病因，由于其发病原因明确，通过阻断HPV的持续感染可以阻断子宫颈癌的发生。因此HPV的检测在宫颈癌的筛查、宫颈癌前病变及宫颈癌治疗后的随访有重要的意义。目前HPV检测的方法很多,但因为功能定位不同,如用于筛查、疗效评估或随访、科研等不同目的,所采用的方法或顺序也有所区别。每种HPV检测方法都有其优缺点，相信通过不断的努力，将来会产生出简便、低廉、准确的HPV检测方法，造福于广大妇女同胞。

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(本文编辑王艳)

通信作者：夏米西努尔·伊力克，女(塔塔尔族)，教授，硕士生导师，博士，研究方向：维中西医结合研究卵巢早衰，E-mail:shamshinur@aliyun.com。

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