CD63分子的研究进展

包晓婧，冯若飞,2，马忠仁

(1. 甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030； 2.西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州730030)

CD63分子的研究进展

包晓婧1，冯若飞1,2，马忠仁2*

(1. 甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030； 2.西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州730030)

[摘要]CD63也被称为溶酶体相关膜蛋白3(LAMP3)，属于四次跨膜蛋白超家族成员，广泛表达于许多细胞类型的表面，与细胞的活化、黏附、变异及肿瘤的侵袭、转移等多种生命过程相关.近年来，随着人们对CD63分子研究的不断深入，发现其越来越多的其他功能.文章就CD63分子的分子结构及功能进行阐述，旨在为该分子进一步研究及应用提供一定的参考.

[关键词]CD63分子；四次跨膜蛋白超家族；结构及功能

CD63为四次跨膜蛋白超家族的一种膜蛋白，其包含4个跨膜域与2个胞外域.广泛表达于活化的嗜碱粒细胞膜表面、血小板、内皮细胞、淋巴细胞、单核细胞以及中性粒细胞膜表面.因其在人黑色素瘤等多种肿瘤发展中起重要作用，故被称为肿瘤转移抑制因子.此外，研究发现，CD63还与血小板的活化、HIV及生殖系统密切相关.四次跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily, TM4SF)是一组分子质量为25~50 kDa的跨膜蛋白质，在多种组织和细胞中广泛表达，至少在哺乳动物28个不同的家族成员、果蝇的37个家族成员和线虫的20个家族成员内均可表达[1,2].TM4SF由4个疏水跨膜结构域构成：即胞外小环(small outer loop,EC1)、胞外大环(larger outer loop,EC2)、胞内小环(small inner loop)和短的胞内尾区(Short cytoplasmic tails)[3].TM4SF成员之间相互关联，与一些家族外蛋白一起形成一个巨大的TM4SF网络，在生命活动中发挥很多重要的功能[4].

1CD63的发现与分布

CD63是第一个被鉴定的tetraspanin成员，最早发现于1988年.发现的CD63为存在于激活的血小板细胞表面的一种蛋白，即血小板糖蛋白40(platelet glycoprotein 40, Pltgp40)[5]，作为活化血小板表面的抗体.还发现CD63就是黑色素瘤抗原491(ME491)，存在于人早期黑色素瘤细胞[6,7].CD63在很多细胞器上也有表达，包括T细胞行使细胞毒作用时的溶酶体颗粒、动脉血管内皮细胞中的 Weibel-Palade 小体、嗜碱和嗜中性粒细胞中的分泌颗粒、巨核细胞以及血小板等.这些细胞器大都处于蛋白水解酶环境，CD63 的功能很可能是保护膜蛋白防止其降解[8].CD63 的膜内羧基端含有定位于溶酶体的信号肽序列 GYEVM，可于溶酶体膜表面表达，若突变信号肽序列，将改变CD63 的定位[9].

2CD63的分子结构

CD63编码基因定位在人的12号染色体上，而在小鼠染色体上却有两个基因座：一是定位在与人类12号染色体具有相关同源性的第10号染色体区域；另一个位点是第18号染色体(命名为CD63-rs,即CD63相关序列).CD63共包含8个外显子，大小为4 000 bp，由238个氨基酸组成.CD63外显子-1的5’侧翼序列具有很多管家基因和生长调节基因启动子的典型特征.该区富含GC，包含三个转录起始位点：转录因子AP-1、Spl和ETF的潜在结合位点.CD63第一个内含子含有一隐藏的启动子，可能是ras应答元件[10～13].

3CD63的功能

3.1　活化分子标记物

CD63为血小板溶酶体完整膜糖蛋白，其相对分子质量为5.3 ×104，在静止血小板表面仅有极少量表达，而在活化血小板表面可大量表达，为血小板活化的特异性分子标志物之一.当血小板被激活时，CD63随活化血小板的“脱颗粒”发生易位，颗粒与血小板质膜融合后，CD63表达在血小板膜表面[14]并经过一系列反应促进血栓形成.近年来对于血小板活化功能亢进与缺血性脑血管病的关系日益受到重视，CD63被认为是一种较为敏感的血小板活化标志物[15].检测这一指标可了解血小板的活化程度[16]，进而对疾病及时地做出诊断及疗效判断.余鑫等[17]发现下肢深静脉血栓(LDVT)患者治疗组CD63均高于对照组，治疗3 d后CD63开始下降，且CD63与治疗前比较差异有显著性，治疗组治疗7 d后CD63 均较治疗前明显降低，差异有显著性(P<0.01)；杨光等[18]在研究中发现急性脑梗死患者血小板CD63表达水平明显高于正常组(P<0.01)；奥扎格雷治疗组与对照组治疗后血小板CD63表达水平较治疗前均有明显下降(P<0.05~0.01)，奥扎格雷治疗组又明显低于对照组，差异有显著性(P<0.05).以上研究均提示CD63与血小板活化密切相关，可作为血小板的活化标记物.

嗜碱性粒细胞在过敏反应中的重要地位已被大家熟知，在固有免疫、获得性免疫和免疫平衡调节等方面的作用也逐渐被认知[19].嗜碱性粒细胞发挥其生物学功能依赖于其活化.研究发现，其活化后表面膜蛋白CD63表达上调[20]，继而被作为嗜碱性粒细胞活化标记蛋白.邓真真等[21]发现检测胞膜CD63的表达量可评估嗜碱性粒细胞的活化情况.

CD63的表达在肺癌发生及发展的各个阶段均不同，与肺癌进展、临床生物学及预后密切相关，可能是评估肺癌等恶性肿瘤预后的重要生物学标记物之一.彭再梅等[22]发现肺癌组织中CD63表达阳性率明显低于肺良性病变组织(X2=14.84，P<0.005)；中高分化、I-II期、 无淋巴结转移的肺癌组织 CD63 表达阳性率明显高于低分化和未分化、 III-IV期及有淋巴结转移者(P<0.01～0.05).故可根据CD63的表达量来预测肺癌的发生及发展.

3.2　肿瘤转移抑制因子

近年研究最多且作用肯定的是CD63在黑色素瘤细胞中的表达，CD63的表达与肿瘤细胞运动性相关.研究发现CD63在人黑色素瘤中可能起着肿瘤抑制基因的作用，限制黑色素瘤的侵袭和进展，与其侵袭和转移发生呈负相关，在早期阶段强表达，在进展阶段呈弱或不表达[23,24].近期研究发现CD63及其mRNA在乳腺癌、非小细胞肺癌及卵巢癌也有一定程度的表达，与这些恶性肿瘤进展、 转移、 侵袭能力及预后密切相关.高水平表达的乳腺癌、肺腺癌及卵巢癌等进展慢、不易发生转移、 且侵袭力弱及预后较好，而其来源的正常组织和良性病变组织表达水平明显高于恶性肿瘤组织[25～,27].方媛媛等[28]在CD63与卵巢癌进展的相关性研究中发现CD63基因在卵巢癌中表达趋势为随期别增加其 mRNA 及蛋白表达逐渐降低，与卵巢癌的发生、发展负相关.

CD63对于肿瘤发生相关的其他蛋白运输也具有调节作用.膜型基质金属蛋白酶1(MTI-MMP)可调节胞外基质的循环，从而促进肿瘤的侵润转移.人胚肾细胞过表达CD63后，细胞表面的MTI-MMP表达水平降低.当MTI-MMP与CD63相互作用时，MTI-MMP便结合到CD63的N-端，导致细胞内摄作用.随后在细胞内的溶酶体内发生降解[29].基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)是一种胞质蛋白，可抑制基质金属蛋白酶(MMP)的活性，从而减弱细胞外基质的降解和重建.TIMP-1与整联蛋白β 1在细胞表面相互作用，保持活性构象.通过实验已证明CD63与TIMP-1及整联蛋白β1存在相互作用，可在人类乳腺上皮MCF10A细胞上与TIMP-1及整联蛋白β1共定位.乳腺上皮细胞中，CD63与TIMP-1在细胞表面相互作用，从而促进TIMP-1和整联蛋白β1的结合，抑制细胞凋亡与极化，使细胞生存力增强.ShRNA介导的CD63下调可显著地降低TIMP-1与细胞表面的结合，TIMP-1与整合素的相互作用，TIMP-1介导的整合素的激活，细胞活性信号.

综上所述，CD63在TIMP-1在细胞表面结合中具有重要的作用，通过TIMP-1对于CD63 /整联蛋白β 1复合物的调节控制细胞活性，从而抑制肿瘤的侵润转移[30].

3.3　CD63与HIV

人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)属逆转录病毒科，慢病毒亚科成员之一，能导致免疫缺陷疾病艾滋病(AIDS).CD63可能与HIV-1 感染相关.CD63在HIV-1感染的细胞分泌小泡中上调表达，它能选择性地聚集在病毒出芽区域并参与合成新病毒颗粒.受HIV-1感染的巨噬细胞中细胞器高表达CD63 .最近的研究还表明，CD63的抗体可以阻碍HIV-1进入巨噬细胞[31].因此推测，CD63可能参与HIV-1病毒间相互识别并促进病毒与细胞小泡结合以利于融合和释放.

单核巨噬细胞是HIV-1感染后的主要储存库.已证明CD63在HIV-1在单核巨噬细胞的复制过程中具有重要作用.Li等[32]发现敲除CD63的巨噬细胞中HIV-1的反转录起始与完成均减少，进而影响HIV-1随后的复制周期，减少早期HIV蛋白Tat及晚期蛋白p24的含量.故CD63与HIV-1在单核巨噬细胞中的反转录过程密切相关.

CD63还与细胞表面关联的趋化因子受体CXCR4相关.表达于质膜的CXCR4能够促进HIV-1进入T淋巴细胞，进而使细胞感染HIV.N端缺失的CD63突变体通过阻断CXCR4在胞膜表面的表达而抑制HIV-1进入T淋巴细胞.CD63突变体导致CXCR4错误定位，CXCR4将不在细胞内的质膜上分布，而是将定位于胞内的细胞器上，如高尔基体、晚期核内体和溶酶体等，进而被溶酶体降解，因此抑制HIV-1侵染.试验表明，敲除内源性CD63及CD63过表达后，CXCR4将相应地在细胞表面表达增强与减弱，减弱与增强HIV的感染.这些结果均说明CD63抑制CXCR4在细胞表面的表达水平，进而抑制HIV-1的感染.而CD63蛋白N端缺失能够增强此功能[33].

3.4　CD63与生殖系统

虽然CD63在小鼠子宫中的功能和调节的相关研究还比较少.但目前，Ma等首次应用基因表达系列分析(SAGE)技术分析了小鼠早期妊娠第五天非着床位点和着床位点子宫的基因表达谱，发现CD63在小鼠子宫的着床位点强表达，暗示其可能在着床过程中发挥关键的作用[34].在人子宫内膜中，与增生期相比，CD63mRNA在分泌期急剧下调，且CD63在分泌期的表达受孕酮下调[35].在胚胎着床过程中，CD63 在小鼠子宫中呈动态表达，即CD63蛋白在妊娠第1～6天子宫内膜腔上皮细胞和腺上皮细胞呈阳性表达.但在基质细胞表达的量和范围却不同：妊娠第1天，无CD63蛋白的表达；妊娠第2天，子宫内膜基质细胞出现微弱阳性表达；以后 CD63蛋白在基质细胞的表达量和表达范围逐渐增强.提示它可能参与了子宫内膜对滋养层细胞有限侵袭的调控[36].

3.5　CD63与免疫

CD63的糖基化增高能调节主要组织相容性复合体MHC-II类分子的重新分布，与树突状细胞(DCs)的成熟过程相关[37, 38].同时，CD63介导DCs的抗体进入细胞，将抗体快速定位至细胞内吞路径[39].CD63在MHC-II类分子介导的抗原提呈作用中有增强CD4+T细胞活化的作用.表达MHC-II类分子的APCs与CD4+T细胞在适应性免疫反应中的相互作用为免疫反应的核心反应，利用转染了 Epstein Barr 病毒的淋巴母细胞系作为表达MHC-II类分子的APCs与CD4+T细胞的特异性内源性表达抗原.我们发现[40]，干扰了淋巴母细胞系的CD63后增加了CD4+T细胞的识别.

CD63在特异性IgE介导的肥大细胞的脱颗粒与过敏反应中具有重要作用.Stefan Kraft等[41]发现敲除CD63将导致肥大细胞的脱颗粒的显著下降，进而减少体内的急性过敏反应，从而确定CD63为过敏反应中的重要组分.

4展望

生理状态下，CD63是血小板及嗜碱性粒细胞的一种分化标志物.病理情况下，可以根据身体的某些相应部位的特异表达异常以及血清中CD63的浓度异常来对疾病作出诊断，并进行判断及预后.目前，几种基于流式细胞术的嗜碱粒细胞及血小板活化检测试验已被广泛应用于过敏性疾病的辅助诊断.故CD63在临床诊断方面具有重要作用.除此之外，CD63还与病毒感染、肿瘤的浸润与侵袭、免疫及生殖功能等具有密切的关系，但是具体的作用机制还有待继续研究，这对于今后的疾病预防与治疗均具有深远的意义.

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[作者简介]包晓婧(1991—)，女，硕士研究生，主要从事西部动物疫病病原学方面的研究.

[通讯作者]*

[基金项目]教育部“长江学者和创新团队发展计划”项目(IRT13091)；国家自然科学基金项目(31460665)；中央高校基本科研业务费专项资金项目(zyp2015005).

[收稿日期]2015-08-20

[中图分类号]TQ93

[文献标识码]A

[文章编号]1009-2102(2015)03-0022-05