TOP2A基因表达与乳腺癌HER2通路的相关性

汤小江，周瑜辉，张 伟，许 刚，何建军

（西安交通大学医学部第一附属医院乳腺甲状腺肿瘤外科，陕西西安 710061）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，严重威胁着女性的身体健康和生活质量。乳腺癌术后辅助化疗可提高生存率、降低复发率和死亡率，而在化疗方案中蒽环类药物具有重要作用。用于乳腺癌化疗的蒽环类药物主要有多柔比星（阿霉素）、表柔比星和吡柔比星，且与其他化疗药物组成常用化疗方案，如CAF方案（环磷酰胺＋多柔比星＋氟尿嘧啶）、CEF方案（环磷酰胺＋表柔比星＋氟尿嘧啶）、AC方案（环磷酰胺＋多柔比星）等。以上几种化疗方案虽然显现出较好的临床疗效，但是临床有效率仍不乐观，仅达25%～30%［1-2］，这可能与化疗药物反应率低或对联合化疗过程中产生的原发或继发性耐药有关。临床研究发现，采用肿瘤组织样本检测相关基因表达的异常情况来预测化疗药物的敏感性和耐药性是可行的［3-7］。TOP2ADNA（topoisomeraseⅡalpha）是常见的化疗疗效预测因子，该基因的表达水平与蒽环类药物的关系已经阐明［8-9］。近年来的研究发现，TOP2A基因表达也受到肿瘤信号通路因子的调控［10］，但还没有明确结论。本研究着重探讨蒽环类药物靶点TOP2A与HER2通路的关键因子的相关性，期望为进一步探讨蒽环类药物的耐药机制提供证据支持。

1 材料与方法

1．1 材料 收集2010～2013年在西安交通大学医学部第一附属医院病理科行免疫组化检查的96例浸润性乳腺癌（HER2蛋白表达1＋以上）手术组织标本，所有病例均经病理科确诊，病理类型及腋窝淋巴结转移情况经病理医师复核，所有患者都为女性，年龄29～71岁，中位年龄52岁。病理类型包括浸润性导管癌80例，浸润性小叶癌9例，导管和小叶混合型癌7例。

1．2 样本采集及检测

1．2．1 样本准备 显微镜下对经甲醛固定、石蜡包埋的肿瘤手术组织进行肿瘤细胞含量分析，选择1块至少含70%肿瘤细胞的蜡块进行切片，刮取肿瘤组织送至广州益善医学检验所进行检测。

1．2．2 检测方法 采用分支DNA液相芯片技术检测TOP2A、HER2、PTEN基因mRNA表达，具体步骤如下：①取适量FFPE样本加入裂解液，56℃下裂解反应2h；②预杂交：将样本裂解液转至孵育板上，加入支持探针-微球、支持延伸探针、缓冲液，55℃震荡孵育过夜；③吸取上清：次日将孵育板放在磁力架上1min，此时磁性微球聚集在底部，吸取弃去上清；④洗涤：加入洗涤液，震荡洗涤1min，孵育板放在磁力架上1min，吸取弃去上清；重复3次；⑤杂交：加入扩增延伸探针和标记探针，50℃震荡反应1h；⑥洗涤：孵育板放在磁力架上1min，吸取弃去上清，用洗涤液洗2次；⑦信号放大：加入链霉亲和素-藻红蛋白，50℃震荡反应30min；⑧洗涤：孵育板放在磁力架上1min，吸取弃去上清，用洗涤液洗2次；⑨读数：加入洗涤液，震荡5min，于Lu minex阅读仪上读取数据；⑩分析：数据分析，得出检测结果。

采用xTAG液相芯片技术检测PI3K突变，该技术步骤可分为微球编码、探针偶联、液相悬浮反应和检测分析。通过多重PCR方法获得各基因外显子上含有常见等位基因型的基因片段，然后进行等位基因特 异 引 物 延 伸 （allele specificprimer extension，ASPE）反应，ASPE引物上的Tag（微球）序列与聚苯乙烯微球上的Anti-Tag序列特异结合，完成杂交反应，杂交后的微球通过Luminex 200系统进行分析，读取每个样品的中位荧光值（MFI）。

1．3 统计学方法 采用W 检验对计量资料的正态性进行考察，并根据正态检验结果选用Spearman秩相关法进行双变量之间的相关性分析。计数资料的比较采用χ2检验，所有统计分析均在SPSS 19．0统计软件包上完成，检验水准为α＝0．05。

2 结 果

2．1 患者的临床基线特征 96例乳腺癌患者的临床基线特征描述见表1。

2．2 TOP2A、HER2、PTEN mRNA的表达情况 采用分支DNA-液相芯片技术检测TOP2A、HER2、PTEN基因的mRNA表达，内参基因为一组基因（B2 M、TBP、TFRC）。该技术不同于定量 PCR 技术，无需RNA提取和PCR扩增，最大限度减少人为操作误差。96例乳腺癌组织标本中TOP2A的平均表达水平为1．54（0．71～6．20），HER2的平均表达水平为0．94（0．72～2．40），PTEN 的平均表达为0．27（0．08～0．73）。基因mRNA表达结果判定标准为统计学四分位法：＜25%是低表达，25%～75%是中表达，＞75%是高表达，同理中表达又分为中表达偏低、中表达和中表达偏高。液相芯片检测基于高、中、低表达的数值是患者基因表达在中国乳腺癌人群中的分布情况，表明该患者在整个人群中处于怎样的水平，基因表达谱见图1。

2．3 PI3K基因突变结果 采用xTAG液相芯片技术对HER2通路关键因子PI3K进行检测，在96例乳腺癌组织样本中，PI3K突变率为19．80%。

2．4 正态分布检验及相关性分析 正态性是进行Pearson关联性分析的前提假设，若变量不满足正态性就无法使用其进行分析，但可用Spearman进行相关分析。因而，本研究采用W 检验、KS检验和D检验对相应变量TOP2A进行正态性考察，发现本研究中的TOP2A的所有正态性检验结果均不满足P大于0．10的条件，故可认为TOP2A不服从正态分布，因此本研究采用Spearman相关进行分析。

表1 96例患者的信息与临床基线特征Tab．1 Information and clinical baseline characteristics of the 96patients

图1 基因表达结果分析Fig．1 Results of gene expressions

2．5 TOP2A及HER2通路关键因子与临床特征的相关性 结果显示，TOP2AmRNA表达水平与性别、年龄、分期、腋窝淋巴结个数、远处转移等病理特征没有明显差异。HER2mRNA表达与腋窝淋巴结数存在统计学差异，PTEN mRNA表达及PI3K基因突变与病理特征没有明显差异（表2）。

表2 基因状态与临床病理特征的相关性Tab．2 Correlation between gene state and clinicopathologic characteristics

2．6 TOP2A与HER2通路关键因子的相关性分析 采用Spearman方法分析TOP2AmRNA表达与HER2、PTEN mRNA表达水平之间的关系，结果显示，TOP2A与HER2存在共表达性，HER2基因高表达时，TOP2A趋向于高表达（P＝0．01）；PTEN 表达与TOP2A表达无显著差异性关系。通过分析TOP2A与HER2通路关键因子PI3K的相互关系，结果显示，PI3K突变与TOP2A表达存在正相关关系，PI3K突变时TOP2A趋向于高表达（P＝0．004，表3）。

表3 基因表达的相关性分析Tab．3 Genetic correlation analysis

3 讨 论

随着蛋白质组学和药物基因组学研究的不断深入，分子标志物指导的乳腺癌个体化治疗已成趋势。利用患者手术标本进行体外基因检测，从而识别患者的个体基因特征，针对患者的个体遗传差异来制定针对性的治疗方案，不仅可以避免不当治疗或无效治疗，提高治疗针对性和有效率，而且可以提高患者生活质量，提高用药依从性，甚至可以减轻患者用药成本。而识别患者个体化基因差异主要通过检测特定基因的表达水平或突变来实现。

多项临床试验研究发现，DNA拓扑异构酶Ⅱ（TOP2A）、微管蛋白β-Ⅲ（TUBB3）、胸苷酸合成酶（TYMS）与乳腺癌的化疗疗效密切相关［10-12］，人类表皮生长因子受体2（HER2）、磷脂酶及张力蛋白同源物（PTEN）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）与乳腺癌靶向药曲妥珠单抗疗效直接相关［13-15］，且对乳腺癌化疗疗效有一定的影响。本文主要研究蒽环类药物靶点TOP2A及其与HER2通路关键因子的相关性，以探讨蒽环类化疗方案耐药的可能影响因素。

TOP2A是拓扑异构酶Ⅱ的一个亚基，是蒽环类药物的主要作用靶点，其编码基因位于第17号染色体，是DNA复制的关键酶，在DNA合成、转录以及在染色体分离、浓缩等过程中发挥重要作用。该酶通过催化DNA双链断裂和再接，导致DNA超螺旋的松解，蒽环类药物因此可趁机嵌入到该酶与DNA结合部位的双链之间，从而干扰了DNA断裂端的重新连接，使其无法修复，从而杀死肿瘤细胞。临床上，TOP2A的变异有两种表现形式，分别是TOP2A基因拷贝数（判断扩增与否）和TOP2AmRNA表达，且有推断认为TOP2A扩增或TOP2A高表达能够为蒽环类药物提供更多的作用靶点［16］；也有研究认为TOP2AmRNA表达是乳腺癌重要的预后因子，较扩增更能预测蒽环类药物疗效［10］，所以蒽环类药物可有效抑制TOP2A过表达的肿瘤细胞增殖。反之，靶点缺失会导致肿瘤对蒽环类药物耐药。这也得到了循证医学的验证。BRASE等［10］研究报道TOP2AmRNA低表达的乳腺癌患者使用蒽环类药物的耐药率提高。

HER2信号通路异常是乳腺癌发生发展的重要机制，其中关键基因也是乳腺癌重要靶向药疗效预测因子。HER2过表达的患者使用曲妥珠单抗疗效显著［13］，然而发生PTEN缺失或PI3K突变的患者却对曲妥珠单抗表现为耐药［15］。这是因为以上关键基因的异常导致了HER2下游信号的激活，尽管曲妥珠单抗有足够的作用靶点，但无法管控下游信号的异常变化，也就起不到肿瘤细胞增殖的作用。随着蒽环类药物的广泛使用及对其耐药性关注度的逐渐提高，临床发现HER2过表达的乳腺癌患者表现为蒽环类药物敏感［17］，且有人认为是因为TOP2A和HER2基因均位于第17号染色体，且位置很近，编码区可能存在相互调控作用［5］。后来有很多研究都证明了HER2过表达也是蒽环类药物药效的重要预测因子［18］。

本研究主要分析了TOP2A与HER2通路关键因子的相关性，检测mRNA采用的是分支DNA-液相芯片技术，检测中无需进行RNA的提取、纯化、逆转录等操作，一方面大大避免了因这些操作造成的误差，保证了检测的准确性和可重复性；另一方面，液相芯片技术采用探针多位点特异性配对、级联信号放大的原理，与传统的real-time PCR相比，可同时检测30多个位点，且引入多个管家基因作对照，使得检测结果更为可靠。检测基因突变采用的是xTAG-液相芯片技术，该技术可高通量检测70个以上的靶标，与其他技术相比，具有灵敏度高、特异性强、量化可重复、结果判定标准化等优势，实现了多通路多靶标、准确可靠的肿瘤样本临床检测应用。

基于可靠的检测技术，我们对结果进行了分析。通过分析基因的表达和突变与临床基线特征之间的关系，可能由于样本量小，没有发现基因与临床特征之间的明显差异。由于随访还在进行，本文尚无法分析基因检测结果与药物疗效的对应关系。关于TOP2A与HER2关系的相关性研究很多，，但对于TOP2A与HER2信号通路之间的关联报道很少。本研究对TOP2AmRNA表达与HER2、PTEN mRNA表达和PI3K突变进行了相关性分析，发现TOP2A与HER2存有共表达现象，这与以往报道具一致性；TOP2A与PTEN没有显著性相关；TOP2A mRNA表达与PI3K突变存有正相关关系，PI3K突变的患者趋向于TOP2A高表达。

基于以上结果和分析，本研究初步验证了HER2通路关键因子HER2、PTEN表达和PI3K突变在调控蒽环类化疗耐药基因TOP2A表达上的作用，这为乳腺癌个体化治疗提供了理论依据。同时也提示我们，在个体化治疗用药前，通过检测多个药物分子标志物如TOP2A、HER2、PTEN、PI3K等可为蒽环类用药方案的选择提供更为系统的依据。此外，本研究也为进一步探讨蒽环类耐药机制提供了实验基础，但还需大样本临床试验进一步研究各基因之间的调控关系。

［1］O'MALLEY F P，CHIA S，TU D，et al．Topoisomerase II alpha and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy［J］．J Natl Cancer Inst，2009，101（9）：644-650．

［2］TUBBS R，BARLOW W E，BUDD G T，et al．Outcome of patients with early-stage breast cancer treated with doxorubicinbased adjuvant chemotherapy as a function of HER2 and TOP2A status［J］．J Clin Oncol，2009，27（24）：3881-3886．

［3］COBO M，ISLA D，MASSUTI B，et al．Customizing cisplatin based on quantitative excision repair cross-complementing 1 mRNA expression：aphaseⅢtrial in non-small-cell lung cancer［J］．J Clin Oncol，2007，25（19）：2747-2754．

［4］SÈVE P，ISAAC S，TRÉDAN O，et al．Expression of class III β-tubulin is predictive of patient outcome in patients with nonsmall cell lung cancer receiving vinorelbine-based chemotherapy［J］．Clin Cancer Res，2005，11（15）：5481-5486．

［5］ARRIOLA E，MARCHIO C，TAN DSP，et al．Genomic analysis of the HER2／TOP2A amplicon in breast cancer and breast cancer cell lines［J］．Lab Invest，2008，88（5）：491-503．

［6］SUN JM，HAN J，AHN JS，et al．Significance of thymidylate synthase and thyroid transcription factor 1 expression in patients with nonsquamous non-small cell lung cancer treated with pemetrexed-based chemotherapy［J］．J Thorac Oncol，2011，6（8）：1392-1399．

［7］周鑫，吴诚义．CD44基因多态性与乳腺癌对蒽环类药物化疗敏感性的关系［J］．吉林大学学报：医学版，2012，39（1）：110-114．

［8］SIMON G，SHARMA A，LI X，et al．Feasibility and efficacy of molecular analysis-directed individualized therapy in advanced non-small-cell lung cancer［J］．J Clin Oncol，2007，25（19）：2741-2746．

［9］SLAMON DJ，PRESS MF．Alterations in the TOP2A and HER2 genes：association with adjuvant anthracycline sensitivity in human breast cancers［J］．J Natl Cancer Inst，2009，101（9）：615-618．

［10］BRASE JC，SCHMIDT M，FISCHBACH T，et al．ERBB2 and TOP2A in breast cancer：a comprehensive analysis of gene amplification，RNA levels，and protein expression and their influence on prognosis and prediction［J］．Clin Cancer Res，2010，16（8）：2391-2401．

［11］HASEGAWA S，MIYOSHI Y，EGAWA C，et al．Prediction of response to docetaxel by quantitative analysis of classⅠ andⅢ β-tubulin isotype mRNA expression in human breast cancers［J］．Clin Cancer Res，2003，9（8）：2992-2997．

［12］LEE SJ，LA CHOI Y，PARK YH，et al．Thymidylate synthase and thymidine phosphorylase as predictive markers of capecitabine monotherapy in patients with anthracycline-and taxanepretreated metastatic breast cancer［J］．Cancer Chemother Pharmacol，2011，68（3）：743-751．

［13］SLAMON DJ，LEYLAND-JONES B，SHAK S，et al．Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2［J］．N Engl J Med，2001，344（11）：783-792．

［14］李向阳，张伟宏．乳癌组织中PTEN的表达［J］．郑州大学学报：医学版，2005，40（6）：1112-1114．

［15］DAVE B，MIGLIACCIO I，GUTIERREZ MC，et al．Loss of phosphatase and tensin homolog or phosphoinositol-3 kinase activation and response to trastuzumab or lapatinib in human epidermal growth factor receptor 2-overexpressing locally advanced breast cancers［J］．J Clin Oncol，2011，29（2）：166-173．

［16］VILLMAN K，SJÖSTRÖM J，HEIKKILÄ R，et al．TOP2A and HER2 gene amplification as predictors of response to anthracycline treatment in breast cancer［J］．Acta Oncol，2006，45（5）：590-596．

［17］ANDRE F，MAZOUNI C，LIEDTKE C，et al．HER2 expression and efficacy of preoperative paclitaxel／FAC chemotherapy in breast cancer［J］．Breast Cancer Res Treat，2008，108（2）：183-190．

［18］DI LEO A，DESMEDT C，BARTIETT JM，et al．HER2 and TOP2A as predictive markers for anthracycline-containing chemotherapy regimens as adjuvant treatment of breast cancer：a meta-analysis of individual patient data［J］．Lancet Oncol，2011，12（12）：1134-1142．