二氧化钛纳米材料对氧化应激状态大鼠肾脏的毒性

沙保勇，刘 洁，冯 浩，景晓红，高 巍

（1．西安医学院基础医学部基础医学研究所，陕西西安 710021；2．西安交通大学医学部第一附属医院麻醉科，陕西西安 710061）

随着纳米技术的迅猛发展，纳米级二氧化钛（nano-TiO2）被广泛应用于化妆品、纺织、塑料、涂料、造纸、食品加工及其包装材料等领域，给人们生产、生活提供了便利，但是其生物安全性逐渐受到关注，近年来成为研究热点［1-3］。

因其用途广泛，纳米TiO2可通过呼吸系统、消化过程、皮肤接触等途径进入机体。已有研究表明，纳米TiO2可引发正常机体的炎症和氧化应激（oxidative stress，OS）反应，并造成肺、肝、肾等多个重要脏器的损伤［4-8］。但目前对纳米TiO2毒性研究多以正常培养细胞或健康动物为基础，而对疾病状态（尤其是氧化应激状态）下的纳米材料毒性研究鲜有报道。

糖尿病肾病是糖尿病最严重和最常见的慢性并发症之一。据统计，我国糖尿病肾病患者占肾病患者的比例超过40%。而OS在糖尿病肾病的发生、发展中起重要作用［9-10］。本研究通过四氧嘧啶构建SD大鼠OS模型，并对正常和OS大鼠进行纳米TiO2染毒，研究其对肾脏的不良影响，希望为纳米材料的安全使用提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料 纳米TiO2、四氧嘧啶和尿素氮（BUN）检测试剂盒购自Sigma公司上海分公司。超氧阴离子自由基（O2-·）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫吸附试剂盒购自罗氏和南京建成公司。其他为国产市售分析纯试剂。

1．2 纳米TiO2表征及其悬液配制 纳米TiO2的形态、晶体结构和电位分别通过西安交通大学JEM-2100F高分辨率TEM显微镜、JSM-6700FSEM显微镜、XRD-7000sX射线衍射仪和Nano ZS90马尔文粒度仪检测获得。纳米TiO2比表面积由BET法测得。

纳米TiO2经140℃干热灭菌后，溶于生理盐水中，超声混匀，配制成0．5、5、50mg／mL 的悬液，4℃保存备用。为尽可能减少TiO2纳米材料的凝聚，每次使用前，纳米TiO2需超声振荡30min。

1．3 动物分组 所有动物实验获得了动物实验管理委员会的批准，并符合动物实验管理条例及保护指南。正常健康雄性SD大鼠36只，体质量为（210±15）g，购自西安交通大学动物实验中心。随机分为正常对照组、OS组（只用四氧嘧啶处理）、NM组（只用TiO2纳米材料处理）和OS-NM组（四氧嘧啶和纳米TiO2共同处理）。

1．4 OS模型的构建与纳米TiO2染毒及毒性检测OS组大鼠通过肌肉注射四氧嘧啶，构建OS模型。其剂量为70mg／kg体质量，分别于注射24、48、72h后取肾组织，检测与OS相关生化指标O2-·、GSH和SOD，并通过监测BUN水平变化及肾脏苏木精-伊红（HE）染色评估四氧嘧啶对肾脏的损伤情况，以获得四氧嘧啶的最佳作用时间。

NM组和进行造模的OS-NM组大鼠通过一次性腹腔注射纳米TiO2的方式进行染毒，剂量为0．5、5、50mg／kg体质量。正常对照组不作任何处理。

染毒48h后，处死各组动物并取血清分析BUN，取肾脏组织制备病理切片并检测O2-·、GSH和SOD等OS生化指标。

2 结 果

2．1 纳米TiO2的表征 本研究所用的纳米TiO2类似棒状，长45～60nm，直径12～18nm，形态如图1中A、B（TEM和SEM）所示。X射线衍射仪测定得到的衍射图谱（图1C），经与国际衍射数据库（JCPDS-ICDD）比较，确定其为金红石型纳米TiO2材料。经Nano ZS90马尔文粒度仪测得纳米材料带负电，电位为（-37．8±3．9）mV（图1D）。BET法测得纳米TiO2的比表面积为158～175m2／g。

图1 纳米TiO2材料的表征Fig．1 Characterizations of nano-TiO2material

2．2 大鼠OS模型的构建 四氧嘧啶注射24、48和72h后，O2-·、GSH和SOD变化结果如图2A所示。与正常对照组大鼠相比，四氧嘧啶注射24h就能导致O2-·水平升高（P＜0．05），GSH和SOD的浓度降低（P＜0．05）；且四氧嘧啶注射72h后，以上3种OS指标变化仍具有统计学意义（P＜0．05）。四氧嘧啶注射后，大鼠BUN水平变化差异无统计学意义（图2B）。与正常大鼠肾脏HE染色切片（图2C）相比，四氧嘧啶注射72h未诱发大鼠肾脏出现明显病理改变（图2D）。可见，四氧嘧啶注射24h便可诱发OS状态，该状态能持续至少48h且不损伤肾组织。

图2 大鼠OS模型的OS指标变化及肾脏BUN与病理改变Fig．2 Changes of OS indices，BUN and renal pathology in rat OS model

2．3 纳米材料对肾脏的毒性 基于大鼠OS模型，四氧嘧啶诱发OS状态持续48h且不损伤肾组织，所以本研究纳米TiO2的作用时间为48h。纳米材料染毒后，所有大鼠未出现死亡现象，活动、饮食等均正常。与正常对照组大鼠肾脏相比，NM组大鼠染毒48h，仅50mg／kg体质量纳米TiO2组出现肾小球肿胀、局灶性细胞数目增多等形态学改变；而OS-NM组大鼠，当纳米TiO2剂量超过5mg／kg体质量时，可见肾小球体积增大、细胞数目增多、肾小管上皮细胞水肿等病理性改变（图3）。纳米TiO2诱导NM组和OS-NM组大鼠BUN显著性增高的剂量分别是50mg／kg和5mg／kg体质量（P＜0．05）；当腹腔注射的纳米材料超过5mg／kg体质量时，经相同剂量的纳米TiO2染毒后，NM组与OS-NM组大鼠的BUN浓度差异有统计学意义（P＜0．01，图4）。这表明，纳米TiO2能损伤正常及OS大鼠的肾脏，且OS状态加剧了纳米材料对肾脏的损伤。

图3 大鼠肾脏HE染色结果Fig．3 HE staining of rat kidney（×400）

图4 纳米TiO2对大鼠BUN的影响Fig．4 Effects of nano-TiO2on BUN level in rats

2．4 肾脏OS指标变化 纳米TiO2染毒48h，检测肾组织O2-·、GSH和SOD生化指标变化，当注射5mg／kg体质量纳米材料时，OS-NM组大鼠O2-·和SOD的较OS组和NM组分别增高，差异均有统计学意义（P＜0．05，图5A）；当注射50mg／kg体质量纳米材料时（图5B），OS-NM组大鼠的O2-·、GSH和SOD水平与OS组及NM组分别比较，差异极显著（P＜0．01）；且 OS组与 NM 组相比较，O2-·和GSH的变化差异有统计学意义（P＜0．05）。但注射0．5mg／kg体质量纳米材料时，OS组、NM组和OSNM组大鼠的OS指标相比较差异均无统计学意义。

以四氧嘧啶和纳米TiO2为两因素，对O2-·、GSH和SOD进行单因变量多因素方差分析后发现，四氧嘧啶与纳米TiO2在导致O2-·水平升高的过程中存在协同作用（F（3，16）＝17．65，P＝0．024）。也就是说，与单一因素相比，四氧嘧啶与纳米TiO2通过协同效应能诱发更为严重的OS状态，加重对肾脏的损伤。

图5 四氧嘧啶与纳米TiO2对肾脏OS指标的影响Fig．5 Effects of alloxan and nano-TiO2on oxidative stress indices of rat kidney

3 讨 论

基于纳米TiO2在日常生活中的广泛应用以及糖尿病肾病的高发生率，本实验以四氧嘧啶制备大鼠OS模型，观察纳米TiO2对正常及OS大鼠肾脏的影响。结果表明，纳米TiO2对正常及OS大鼠肾组织均有损伤，且四氧嘧啶与纳米TiO2间的协同效应能加剧肾脏的损伤。

本研究以注射四氧嘧啶的方式制备大鼠OS模型，四氧嘧啶对啮齿目动物的胰岛β细胞具有特殊的破坏作用，能抑制胰岛素分泌，通过产生自由基引起糖尿病［11］。已有研究证明，四氧嘧啶注射超过72h能损伤SD大鼠重要脏器肝脏［12］。因此，本实验中四氧嘧啶的最长作用时间为72h，且结果显示四氧嘧啶注射24h便可诱发OS状态，该状态能持续至少48h且无肾脏损伤。

BUN是反映肾功能的主要指标，其可通过血液循环经肾小球滤过后随尿液排出体外［13］。若肾功能受损，肾小球的滤过功能损伤，其排除尿素的能力自然下降，最终导致血中BUN水平升高。本研究发现注射四氧嘧啶制备OS大鼠模型及纳米TiO2组的血清中BUN的水平明显上升，并引起组织学上的肾小球肿胀和毛细血管充血，以及肾小管上皮细胞空泡变性，可能是因为纳米TiO2颗粒小，进入体内后很难清除，所以在肾脏中导致大量滞留并引起肾小球滤过功能的变化［14］。

纳米TiO2产生毒性的重要机制之一是诱导机体内自由基水平升高，而自由基的异常积累和GSH的过度损耗会破坏氧化-抗氧化平衡，并产生OS［15-16］。本研究中，纳米TiO2能加剧OS状态下肾脏的损伤，可能与四氧嘧啶与纳米TiO2能协同导致O2-·水平的升高，诱发更为严重的OS状态有关。近年的研究表明，OS在糖尿病肾病的发生和发展中发挥了至关重要的作用，增多的自由基会导致肾小球基底膜磷脂发生过氧化，损伤基底膜并使其增厚，增多糖基化终末产物并导致肾脏细胞的凋亡［17-19］。因此，糖尿病肾病患者应科学对待纳米TiO2产品，避免因误用诱发严重的OS状态。

综上所述，与正常健康大鼠相比，纳米材料TiO2能加重OS大鼠肾脏的损伤，潜在机制为四氧嘧啶与纳米TiO2能协同诱发更为严重的OS状态。本研究为疾病患者科学、安全接触纳米TiO2提供了一定的参考和实验依据。

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