内皮祖细胞对睾丸扭转后患侧睾丸的影响

曹　朴，薛建新，张王山，贾瑞鹏

(1.东南大学附属第二医院泌尿外科，江苏　南京　210003；2.南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院)泌尿外科，江苏　南京　210006)



内皮祖细胞对睾丸扭转后患侧睾丸的影响

曹朴1,2，薛建新1,2，张王山1，贾瑞鹏2

(1.东南大学附属第二医院泌尿外科，江苏南京210003；2.南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院)泌尿外科，江苏南京210006)

摘要：为了探讨内皮祖细胞(EPCs)移植对睾丸扭转(TT)复位后患侧睾丸的影响，获取大鼠骨髓源性EPCs，进行分组：对照组(sham组，左侧睾丸不扭转)、缺血再灌注损伤组(IRI组，左侧TT 720°2 h后复位。)、EPCs移植组(EPCs组，睾丸复位后经股静脉注射EPCs悬液)。术后5 d，左侧睾丸称重，冰冻切片技术检测EPCs归巢，HE染色检测左侧睾丸组织病理变化，Makler评分(TMS)评价睾丸生精功能。术后5 d，EPCs归巢于左侧睾丸。IRI组、EPCs组左侧睾丸重量低于sham组(P<0.05)，EPCs组左侧睾丸重量高于IRI组(P<0.05)。IRI组左侧睾丸病理损伤严重，EPCs组左侧睾丸病理损伤较IRI组减轻。IRI组、EPCs组TMS均低于sham组(P<0.05)，EPCs组TMS高于IRI组(P<0.05)。TT可致患侧睾丸生精功能受损，EPCs移植可改善患侧睾丸生精功能障碍。

关键词：睾丸扭转；再灌注损伤；内皮祖细胞；细胞移植

睾丸扭转(testicular torsion，TT)为一种典型的缺血再灌注损伤(ischaemia-reperfusion injury，IRI)，可导致不同程度的生精功能障碍，是尚需解决的难题[1]216。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一种具有定向归巢、增殖、分化为成熟内皮细胞特性的多能干细胞，EPCs移植可改善脑、睾丸等组织IRI[2]，[3]2 137，[4]。目前，尚少见EPCs移植对TT复位后患侧睾丸影响的报道。因此，本研究通过建立TT模型，进行EPCs移植，观察EPCs移植对TT复位后患侧睾丸的影响。

1材料和方法

1.1　实验材料

健康雄性SD大鼠购于南京军区总医院动物实验中心，体重170~220 g，饲养于25 ℃室温，自由进食水。所用大鼠均由动物实验委员会授权使用。EGM-2培养液购自美国Lonza公司。纤维连接蛋白购自美国Sigma公司。培养瓶购自美国Corning公司。0.25%胰蛋白酶/EDTA购自美国Gibco公司。抗CD31抗体、抗CD34抗体购自武汉博士德有限公司。抗Ⅷ因子抗体购自英国Abcam公司。凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。氯胺酮注射液购自福建古田药业有限公司。OCT冰冻切片包埋剂购自美国SAKURA公司。荧光显微镜购自日本 Olympus公司。冷电荷耦合设备(CCD)相机购自日本Olympus公司。

1.2　实验方法

1) EPCs分离、培养、鉴定。SD大鼠处死后，获取四肢长骨骨髓细胞，密度梯度离心法收集单个核细胞，使用EGM-2培养液培养。将培养10 d后的贴壁细胞，进行CD31、CD34、Ⅷ因子免疫细胞化学染色[3]2 136。

2) TT模型的建立，分组。按Turner法进行操作，在室温25 ℃条件下，氯胺酮50 mg/kg腹腔麻醉大鼠，切开左侧阴囊，游离出睾丸、附睾，切断睾丸引带，左侧睾丸沿其长轴，顺时针旋转720°，用无菌丝线将左侧睾丸固定于阴囊内2h，然后复位，缝合切口。Sham组(假手术组)：6只，左侧睾丸不扭转并固定阴囊内2 h；IRI组(缺血再灌注组)：6只，左侧睾丸顺时针旋转720°，2h后复位，立即经大鼠股静脉注射1 mL生理盐水；EPCs组(细胞移植组)：6只，左侧睾丸顺时针旋转720°，2h后复位。立即经大鼠股静脉注射加入1 mL EPCs悬液[5]62。

3) EPCs移植及示踪。将培养10 d的贴壁EPCs浓度调整为1.0×106个/mL。TT复位后，经股静脉注入1 mL EPCs悬液。移植细胞示踪：将Ad-eGFP转染的 EPCs(Ad-eGFP EPCs)浓度调整为1.0×106个/mL， TT复位后经股静脉注入1 mL Ad-eGFP EPCs。5 d后处死大鼠，制作左侧睾丸组织冰冻切片。在荧光显微镜下观察，发出绿色荧光者为Ad-eGFP EPCs。

4) 睾丸称重。细胞移植术后5d，处死大鼠，留取左侧睾丸组织。剥离睾丸周围筋膜，生理盐水冲洗，无菌纱布拭净水分，微量天平称重。睾丸重量可间接反映睾丸生精功能。

5) 睾丸组织病理学检测。左侧睾丸标本固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制备厚度为5 μm的薄片，行常规HE染色。

6) 睾丸组织Makler评分(testicular makler score， TMS)。每例标本切片镜下观察10个曲细精管断面，分别测定曲细精管内径D、管周膜厚度M、管壁生精细胞层数P、生殖细胞成熟程度S，每个项目按0~5分评分，满分20分，然后计算平均得分，即为Makler评分。

2结果

2.1　EPCs归巢

Ad-eGFP EPCs移植5d后，在荧光显微镜下可观察到左侧睾丸组织中出现绿色荧光细胞(见图1)，说明移植的EPCs可定向归巢于左侧睾丸组织[3]2 138。

2.2　左侧睾丸重量比较

术后5 d，IRI组、EPCs组左侧睾丸重量均低于sham组，差异有统计学意义(P<0.05)；EPCs组左侧睾丸重量高于IRI组，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)，表明TT复位可导致左侧睾丸功能严重受损，EPCs移植可改善左侧睾丸功能。

表1　术后5 d各组左侧睾丸重量

注：*：与sham比较，P<0.05；#：与IRI组比较，P<0.05

2.3　左侧睾丸组织病理学变化

sham组：生精小管结构正常，生精上皮厚度正常，排列整齐，大量各级生精细胞形态正常(见图2a)；IRI组：生精小管结构紊乱，生精上皮层数少，各级生精细胞大量丢失，排列紊乱，生精细胞成熟障碍，可见炎性细胞浸润(见图2b)；EPCs组：睾丸组织生精上皮层较IRI组增厚，生精细胞增多(见图2c)。

2.4　左侧睾丸TMS

术后5 d，IRI组、EPCs组TMS 均低于sham组，差异有统计学意义(P<0.05)，说明IRI组、EPCs组左侧睾丸均存在不同程度生精功能障碍。EPCs组TMS高于IRI组，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)，说明EPCs移植可减轻左侧睾丸组织生精功能障碍。

表2　术后5 d左侧睾丸各组 TMS 情况

注：*：与sham比较，P<0.05；#：与IRI组比较，P<0.05

3讨论

3.1　EPCs特征及移植

1997年有学者[6]首次从人外周血中分离出EPCs，并证实其可促进血管新生，成为血管新生研究的热点。EPCs在机体刺激因子的作用下，动员、归巢、分化为内皮细胞，通过自分泌/旁分泌机制，产生多种细胞因子，包括VEGF、bFGF、IGF等，可进一步动员EPCs归巢至受损组织，共同调节微环境变化，改善机体缺血性病变[5]64，[7]。机体在病理状态下，EPCs数量及质量发生改变，难以满足机体需要，进行EPCs移植成为一种治疗选择。目前，EPCs移植治疗缺血性心脏病、肢体缺血、肾脏IRI等疾病，已显示良好的治疗效果和应用前景。

3.2　睾丸TT概述

TT是一种严重的外科急症，多发生于青少年及新生儿[8]314。一旦确诊，即使外科干预，睾丸功能仍可受损[9]427。TT为一种典型的IRI，其损伤程度取决于TT的时间和程度，可导致不同程度的生精功能障碍，包括生精细胞凋亡坏死、睾丸萎缩、精子质量下降，甚至不育[1]216，[3]2 137，[8]316。

3.3　TT对患侧睾丸的影响

犬TT 450°~540°可彻底阻断睾丸动脉血供。大鼠TT 720°维持1h，即可导致患侧睾丸功能严重受损，并产生大量活性氧基团(reactive oxygen species，ROS)，引起氧化应激反应[10-11]。TT 6h内复位，为睾丸存活的临界时间，否则睾丸存活机会显著降低。在本实验中，笔者将左侧TT 720°维持2 h，左侧睾丸出现严重病理损伤，包括：生精小管结构紊乱、上皮厚度明显变薄、各级生精细胞大量丢失、炎性细胞浸润等。结果表明：通过TT 720°维持2h的方式建立TT复位模型可行，达到预期效果，与文献[12]报道的结果类似。睾丸重量可间接反映睾丸生精功能，睾丸重量下降意味着生精功能受损。在本实验中，IRI组睾丸重量明显低于sham组，表明单侧TT复位可导致患侧睾丸功能严重受损，可能与曲细精管内径缩小、生精细胞凋亡、生精细胞成熟障碍、睾丸纤维化萎缩等有关。EPCs组睾丸重量小于sham组(P<0.05)，高于IRI组(P<0.05)，说明EPCs移植可降低睾丸IRI，改善患侧睾丸生精功能。

3.4　EPCs移植对患侧睾丸功能的影响

学者对TT治疗进行了积极的探索，包括药物、低温、高压氧等，显示出一定的疗效，但仍有许多问题尚未解决[13]。关于EPCs对睾丸IRI影响的报道较少。在前期研究中，笔者采用EPCs移植治疗大鼠TT复位后生精功能障碍，通过TUNEL法检测生精细胞凋亡，以此评价睾丸生精功能，结果发现：EPCs移植可显著降低生精细胞凋亡，改善睾丸IRI，对患侧睾丸生精功能产生保护作用[3]2 138。

TMS通过测量曲细精管内径、管周膜厚度、管壁生精细胞层数、生殖细胞成熟程度，可较直观反映睾丸生精功能[14]。TMS越高，睾丸生精功能越好。在本实验中，术后5d，IRI组左侧睾丸TMS显著低于sham组，表现为睾丸曲细精管内径缩小，管壁生殖细胞层数减少，生殖细胞成熟障碍，说明TT复位可导致患侧睾丸IRI。EPCs组TMS显著高于IRI组(P<0.05)，表明EPCs移植可减轻患侧睾丸组织病理损伤，改善生精功能障碍。通过TMS进一步证实了笔者前期的研究结果[3]2 138。但EPCs对TT复位后生精功能的保护机制尚不清楚，需进一步研究。

4结论

单侧TT 720°2 h后复位，可导致患侧睾丸严重IRI。EPCs移植可改善患侧睾丸生精功能障碍，并对生精功能产生保护作用。

参考文献：

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[3]曹朴，薛建新，贾瑞鹏，等.内皮祖细胞对大鼠睾丸扭转复位后生精功能的影响[J].中华医学杂志，2011，91(30)：2 135-2 138.

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(责任编辑：何学华)

Effect of EPCs on Function of Ipsilateral Testes after Testicular Torsion

Cao Pu1,2,Xue Jian-xin1,2,Zhang Wang-shan1，Jia Rui-peng2

(1.Department of Urology, Second Affiliated Hospital of Southeast University, Nanjing Jiangsu 210003, China; 2.Department of Urology, Nanjing Medical University Affiliated Hospital of Nanjing(Nanjing First Hospital), Nanjing Jiangsu 210006, China)

Abstract:In order to investigate the effect of endothelial progenitor cells (EPCs) transplantation on function of ipsilateral testes after testicular torsion, bone-marrow-derived EPCs were obtained from rats. The rats were divided into 3 groups: control group (sham group, the left testes were not twisted), ischemia reperfusion injury group(IRI group, they were in detorsion after the left testes were twisted 720° for 2 h), endothelial progenitor cells transplantation group(EPCs group, EPCs suspension was injected into rats through the femoral vein after testicular detorsion). On the 5th day after operation, the rats' left testes were weighed, EPCs homing was detected by using the technique of frozen section. The pathological changes in the left testes were examined by HE staining technique. Spermatogenesis was evaluated by testicular Makler score(TMS). On the 5th day after operation, transplanted EPCs homed into the left testes. The left testicular weight in rats of the IRI group and EPCs group was significantly lower than that in the sham group(P<0.05). The left testicular weight in the EPCs group was higher than that in the IRI group, the difference was significant (P<0.05). The left testis underwent serious pathological changes in IRI group. Compared with IRI group, the impaired changes in the left testes from the EPCs group mitigated. TMS in the IRI group and EPCs group was significantly lower than that in the sham group(P<0.05). TMS in rats of EPCs group was higher than that in the IRI group(P<0.05). TT can impair spermatogenesis in twisted testis. EPCs transplantation is effective for improving the spermatogenic disfunction in twisted testes.

Key words:testicular torison; reperfusion injury; endothelial progenitor cells; cell transplantation

作者简介：曹朴(1979-)，男，安徽长丰人，主治医师，硕士，研究方向：泌尿外科及男科学的基础与临床研究。

收稿日期：2014-06-04

中图分类号：R691.5

文献标志码：A

文章编号：1672-1098(2015)04-0045-04