乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌协同灭螺效果研究

李　威

(江汉大学文理学院生物与环境工程学部，湖北 武汉 430056)



Preparation of Starch Grafted Acrylamide Flocculants and Its

Application in Treatment of Wastewater During Papermaking

LIU Ting-ting，ZHANG Dao-hong

(Key Laboratory of Catalysis and Materials Science of the State Ethnic Affairs

Commission & Ministry of Education，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China)

Abstract：Using starch，acrylamide and [2-(methacryloyloxy)ethyl]trimethylammonium chloride as main raw materials,two kinds of high starch content flocculants，starch grafted acrylamide and cation-modified starch grafted acrylamide were prepared.Effects of monomer concentration，initiator concentration,gelatinization temperature,grafting reaction time,and grafting reaction temperature on the monomer conversion and starch content were discussed.Applying the two kinds of flocculants to deal with papermaking wastewater，they all showed excellent flocculation efficiency compared with several industrial polyacrylamide flocculants. Cooperatively molluscicidal effects of ethanol extracts from Sapium sebiferum dry leaves and Streptomycete were studied.Results showed that,ethanol extracts from S.sebiferum dry leaves had better molluscicidal activity than from S.sebiferum fresh leaves.Treating for 72 h，LC50of ethanol extracts from fresh and dry leaves of S.sebiferum was 160.21 mg·L-1,131.40 mg·L-1，respectively.When treated with ethanol extracts from dry leaves of S.sebiferum and Streptomycete dilutions for 24 h，LC50was 53.95 mg·L-1.It proved that ethanol extracts from dry leaves of S.sebiferum and Streptomycete dilutions had obvious cooperatively molluscicidal effect.Therefore,the study will provide theoretical basis for reasonable using of plant resources and exploring of new ecological molluscicidal methods.

10.3969/j.issn.1672-5425.2015.12.015

乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌协同灭螺效果研究

李威

(江汉大学文理学院生物与环境工程学部，湖北 武汉 430056)

摘要：研究了乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌协同灭螺效果。结果表明，用乌桕鲜叶乙醇提取液和干叶乙醇提取液浸杀钉螺72 h后的LC50分别为160.21 mg·L-1、131.40 mg·L-1，表明乌桕干叶乙醇提取液的灭螺活性更高；将乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌稀释液联合浸杀钉螺24 h，LC50为53.95 mg·L-1，表明乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌稀释液联合灭螺具有很明显的协同效应。为生态灭螺植物资源的合理使用及探索新的高效生态灭螺方法提供了理论依据。

关键词：乌桕叶；乙醇提取液；链霉菌；灭螺效果

血吸虫病是一种严重危害人类身体健康的人畜共患传染病[1]。血吸虫的生活史中唯一的中间宿主就是钉螺[2]。杀灭钉螺是切断和控制血吸虫病传播的重要环节之一[3]。目前，大规模使用氯硝柳胺、氯代水杨胺等化学灭螺剂所导致的环境污染比血吸虫本身造成的污染更严重，对人们的健康危害更大；而物理灭螺法(如土埋、沟渠硬化、翻耕种植等)工程浩大、耗资多，且很难一次完成[4]。生物灭螺法是利用竞争种群、螺类天敌和灭螺植物资源达到灭螺目的，目前已发现20多种植物具有较强的灭螺作用，国内研究大多集中在枫杨、夹竹桃、天南星等植物[5]。

乌桕叶中含有多种黄酮类和皂苷类化合物，具有灭螺作用的主要是其中的黄酮类化合物。黄酮类化合物易溶于乙醇等强极性有机溶剂，而乙醇毒性小且易回收利用。另外，乌桕叶中的谷甾醇、槲皮素、槲皮苷、莽草酸、没食子酸乙酯等化合物也具有一定的灭螺活性。当这些物质积累到一定程度后会造成钉螺营养物质摄取障碍，使得钉螺体内糖原含量下降，能量代谢受到影响，体内转氨酶活性变化，蛋白质分解加快，最终导致钉螺死亡率上升[6-7]。

杨建明等[8]从疫区钉螺孳生地的土壤中筛选出一株有灭螺活性的紫红链霉菌。研究表明，用紫红链霉菌摇瓶发酵稀释液浸泡钉螺后，其体内ATP利用也发生障碍。尽管微生物和微生物农药对钉螺灭除也有一定优势，但单独使用启效缓慢、用量大且成本高[9]。利用活体植物的有效成分和微生物协同灭螺、构建群落生态灭螺是当今灭螺研究的热点[10-11]。

研究表明，乌桕叶的水浸液和乙醇提取液均有一定的灭螺作用,但乌桕叶乙醇提取液与链霉菌协同灭螺的研究报道较少。为此，作者在比较乌桕干叶和鲜叶乙醇提取液灭螺活性的基础上，将乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌稀释液联合使用评价其灭螺活性，旨在为生态灭螺植物资源的合理使用及探索新的高效生态灭螺方法提供依据。

1实验

1.1　材料与试剂

钉螺，采自武汉黄陂区梅店水库周围水域，22 ℃恒温光照培养箱中以浮萍饲养，选用生长一致、活力强的阴性成螺进行实验；乌桕，采自梅店水库周围道路旁，洗净，阴干，室温保存；紫红链霉菌，湖北大学微生物研究室提供。

乙醇，工业纯，武汉银河化工有限公司。

1.2　方法

1.2.1乌桕鲜叶和干叶乙醇提取液的制备

将乌桕鲜叶置于60 ℃烘箱中烘12 h，捣碎后磨成粉，过80目筛得到乌桕叶原粉。称取10 g乌桕叶原粉，用95%乙醇溶液浸泡12 h后，再用超声波处理30 min，过滤，滤液用真空旋转蒸发仪蒸出乙醇残液，加无氯清水配制成1 g·L-1的乌桕干叶乙醇提取母液，备用。

将乌桕鲜叶剪成1 cm2碎片，无需烘干，直接捣碎磨成粉，按上述方法制备1 g·L-1的乌桕鲜叶乙醇提取母液，备用。

1.2.2链霉菌稀释液的制备

参照柯文山等[5]的方法，将紫红链霉菌菌种活化培养3次后，配制成浓度为5×108个·mL-1的原液，用蒸馏水稀释10倍后得到链霉菌稀释液。

1.2.3室内钉螺毒杀实验

采用浸泡毒杀法[12]，在室温(20±5) ℃下进行钉螺毒杀实验。首先将乌桕干叶乙醇提取液和鲜叶乙醇提取液均稀释成100 mg·L-1、200 mg·L-1、300 mg·L-1、400 mg·L-1，以乙醇水溶液作为对照，每处理重复3次。毒杀钉螺的试管内径为1.8 cm、高度为20 cm。按每20只钉螺为1组分别放入试管中，将乌桕干叶/鲜叶乙醇提取液移入试管中，溶液高度约为试管高度的4/5，以少量浮萍作为食料，并用尼龙网塞住试管口。分别处理24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后取出钉螺，用无氯清水反复冲洗数次，参照Santos等[13]的方法判断钉螺死亡与否，计算死亡率。

然后将乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌稀释液混合，配制成不同浓度混合液：20 mg·L-1(0.2份乌桕干叶乙醇提取母液+1份链霉菌原液+8.8份蒸馏水)、40 mg·L-1(0.4份乌桕干叶乙醇提取母液+1份链霉菌原液+8.6份蒸馏水)、60 mg·L-1(0.6份乌桕干叶乙醇提取母液+1份链霉菌原液+8.4份蒸馏水)、80 mg·L-1(0.8份乌桕干叶乙醇提取母液+1份链霉菌原液+8.2份蒸馏水)、对照组(0.2份乙醇水溶液+1份链霉菌原液+8.8份蒸馏水)，每处理重复3次。

2结果与讨论

2.1　乌桕鲜叶和干叶乙醇提取液的灭螺活性(图1)

图1　乌桕鲜叶(a)和干叶(b)乙醇提取液的灭螺活性Fig.1　Molluscicidal activity of ethanol extracts from fresh leaves(a) and dry leaves(b) of S.sebiferum

由图1可看出，乌桕鲜叶和干叶乙醇提取液均有很强的灭螺活性。钉螺死亡率均随着乙醇提取液浓度的增大而明显升高；乙醇提取液浓度相同时随着处理时间的延长，钉螺死亡率也呈上升趋势。从图1a可看出，乌桕鲜叶乙醇提取液浓度为300 mg·L-1、400 mg·L-1时，处理48 h后的钉螺死亡率均达到50%以上；处理72 h后，钉螺死亡率均明显升高；处理120 h 后，钉螺死亡率均超过80%，且当乌桕鲜叶乙醇提取液浓度超过300 mg·L-1时，钉螺全部死亡。从图1b可看出，乌桕干叶乙醇提取液浓度为300 mg·L-1、400 mg·L-1时，处理48 h后的钉螺死亡率均超过60%；处理72 h后的钉螺死亡率均超过处理24 h的一倍以上;处理120 h后，钉螺死亡率均超过90%；当乌桕干叶乙醇提取液浓度为400 mg·L-1时，处理24 h后的钉螺死亡率就可达到45%；当乌桕干叶乙醇提取液浓度为300 mg·L-1时，处理48 h后的钉螺死亡率就超过60%。表明，乌桕干叶乙醇提取液的灭螺活性较乌桕鲜叶乙醇提取液更强。

对乌桕鲜叶和干叶乙醇提取液浸杀钉螺72 h、96 h的数据进行分析，结果见表1。

由表1可知，乌桕鲜叶乙醇提取液浸杀钉螺72 h和96 h后，LC50分别为160.21 mg·L-1、125.92 mg·L-1;而乌桕干叶乙醇提取液浸杀钉螺72 h和96 h后，LC50分别为131.40 mg·L-1、105.41 mg·L-1。可见，乌桕干叶乙醇提取液的灭螺活性优于乌桕鲜叶乙醇提取液的灭螺活性。因此，选用乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌稀释液混合，评价乌桕叶乙醇提取液与链霉菌稀释液的协同灭螺效果。

表1　乌桕鲜叶和干叶乙醇提取液的灭螺活性Tab.1　Molluscicidal activity of ethanol extracts from freshleaves and dry leaves of S.sebiferum

2.2　乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌的协同灭螺活性(图2)

图2　乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌的协同灭螺活性Fig.2　Cooperatively molluscicidal activity of ethanol extractsfrom dry leaves of S.sebiferum and Streptomycete

由图2可看出：(1)乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌稀释液联合使用对钉螺有很强的毒杀作用。当单独用链霉菌稀释液处理120 h后，钉螺死亡率达到50%；当用乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌稀释液联合处理72 h后，钉螺死亡率即达到49%。(2)钉螺死亡率随着混合液浓度的增大、处理时间的延长而明显上升。40 mg·L-1混合液浸杀钉螺48 h的死亡率为52%，而60 mg·L-1混合液浸杀钉螺24 h的死亡率就达到50%；80 mg·L-1混合液浸杀钉螺48 h的死亡率超过80%，浸杀120 h后钉螺全部死亡。(3)当混合液处理时间从24 h延长到48 h时，钉螺死亡率迅速上升；48~72 h时，死亡率上升平缓；72~120 h，死亡率又明显上升。

对乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌稀释液联合浸杀钉螺24 h、48 h的数据进行分析，结果见表2。

由表2可知，乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌稀释液联合浸杀钉螺24 h和48 h后，LC50分别为53.95 mg·L-1、27.81 mg·L-1。表明，乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌稀释液协同灭螺效果明显优于单一成分。

表2　乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌的协同灭螺活性Tab.2　Cooperatively molluscicidal activity of ethanolextracts from dry leaves of S.sebiferum and Streptomycete

2.3　讨论

(1)乌桕鲜叶和干叶乙醇提取液中均含有毒杀钉螺的化学物质，灭螺效果较明显，且乌桕干叶乙醇提取液的灭螺效果更好，说明乌桕叶中的灭螺活性成分应为多种有效化学成分的混合[14]。研究表明，乌桕叶水提液也有一定的灭螺效果，但要达到相同灭螺效果所需的乌桕叶会很多。

(2)乙醇提取是提取植物有效成分的常见方法。当田间试验大规模应用乙醇提取灭螺植物中有效成分时，存在提取液成本高的缺点，植物灭螺机理尚需探讨。

(3)微生物(如链霉菌)具有较好的灭螺效果，且与乌桕干叶乙醇提取液联合灭螺具有很明显的协同效应。低浓度下协同灭螺效果比单一成分要好，但协同增效有一定的时效性，处理前期(<48 h)和处理后期(>72 h)，钉螺死亡率上升更明显。

(4)由于链霉菌稀释后含量发生变化，与乌桕干叶乙醇提取液联合灭螺时，容易受到试验环境条件的影响，特别是田间试验大规模应用时，自然环境因子的制约会更明显。因此，微生物联合灭螺植物毒杀钉螺时，需要进一步确定协同增效的条件。

3结论

研究了乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌协同灭螺效果。结果表明，乌桕鲜叶乙醇提取液和干叶乙醇提取液浸杀钉螺72 h后的LC50分别为160.21 mg·L-1、131.40 mg·L-1，表明乌桕干叶乙醇提取液的灭螺活性更高；将乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌稀释液联合浸杀钉螺24 h，LC50为53.95 mg·L-1，表明乌桕干叶乙醇提取液与链霉菌稀释液配伍灭螺具有很明显的协同效应。为生态灭螺植物资源的合理使用及探索新的高效生态灭螺方法提供了理论依据，也为采用植树造林控制湖区血吸虫的蔓延提供了树种的选择依据。

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Study on Cooperatively Molluscicidal Effects of Ethanol Extract

from Sapium Sebiferum Dry Leaves and Streptomycete

LI Wei

(Department of Biological and Environmental Engineering,College of Arts and

Sciences of Jianghan University,Wuhan 430056,China)

Keywords：Sapium sebiferum leaf；ethanol extract;Streptomycete；molluscicidal effect

中图分类号：S 476+.11

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2015)12-0063-04

作者简介：李威(1983-)，男，湖北孝感人，讲师，主要从事生物化学与微生物制药研究，E-mail：535191627@qq.com。

收稿日期：2015-09-11

基金项目：湖北省武汉市市属高校科研项目(武教高2009K190)