赤小豆萌芽最佳抗敏天数及相关活性物质研究

李 丽,任晗堃,董银卯,宋丽雅,张小慧,刘 畅

(北京市植物资源重点实验室,北京工商大学,北京 100048)



赤小豆萌芽最佳抗敏天数及相关活性物质研究

李 丽,任晗堃,董银卯*,宋丽雅,张小慧,刘 畅

(北京市植物资源重点实验室,北京工商大学,北京 100048)

通过透明质酸酶体外抑制实验测定不同萌芽天数(0～6d)赤小豆抗敏活性,同时测定不同萌芽天数(0～6d)赤小豆中总皂苷、总多酚及总多糖含量,并与透明质酸酶抑制活性进行相关性分析。结果表明:赤小豆萌芽第4d抗敏效果最佳,各成分在萌芽过程中的变化不同,结合萌芽过程中多酚、多糖和皂苷类成分总含量的变化,确定多酚类物质是赤小豆萌芽中的主要抗敏活性物质。

赤小豆,萌芽,抗敏,活性成分

赤小豆(Vignaumbellata),别名红小豆,先载于《神农本草经》。其与赤豆(P.angularis)的外形和习性都很相似,不易区分,但赤小豆种子呈圆柱形而稍扁,两端较平,长5～8mm,表面暗红色或紫红色,平滑微有光泽[1]。赤小豆在我国资源分布广泛,主产于我国浙江、江西、湖南、广东、广西等南部各省[2]。自古以来,因其良好的清热利湿、解表散邪功效,在治疗水肿、脚气、黄疸、泻痢、便血、痈肿等症时,发挥重要作用[3],现代药理学研究表明,其具有增强免疫力、降血糖、保肝及抗肿瘤的作用[4-9]。

国内外已有研究证明大豆、绿豆、赤豆、荞麦等多种谷物具有重要的抗敏功效,为抗敏食品的重要来源。红小豆乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位可以完全抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞NO产生,iNOS和COX-2表达,TNF-α和IL-6的释放,并通过下调ERK/p38-和NF-κB介导的信号传导途径发挥抗敏活性,其发挥抗敏活性的主要物质为儿茶素7-O-β-D-葡萄糖苷为主的多酚类成分[14]。种子萌芽是天然的激发过程,随着萌芽过程酶活性提高,活性物质增加,新陈代谢水平提高,使得包括多酚在内的次级代谢产物大量生成,从而提高植物本身的药理活性。

赤小豆中主要含有酚类、五环三萜、皂苷、黄酮、鞣质等活性成分,但目前尚未有研究赤小豆萌芽过程中抗敏活性变化及相关成分分析的报道,本文通过透明质酸酶抑制实验筛选赤小豆具有最佳抗敏活性的萌芽天数,通过对萌芽过程中总皂苷、总多酚及总多糖含量变化的测定及与抗敏活性的相关性分析,总结赤小豆萌芽中发挥抗敏活性的主要成分。

表1 透明质酸酶实验步骤Table1 The steps of hyaluronidase experiment

注:“+”为此项添加,“-”为此项不添加。1 材料与方法

1.1 材料与仪器

赤小豆(种子) 购于北京市永辉超市,原产地吉林；透明质酸酶 Sigma公司；透明质酸钠(Solarbio)及乙酰丙酮、没食子酸、葡萄糖、齐墩果酸、香草醛、甘草酸二钾对照品 均为国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸、乙醇、甲醇、苯酚、高氯酸、冰醋酸 北京化工厂；盐酸 北京北化精细化学品有限责任公司；碳酸钠 西陇化工股份有限公司；Folin-Ciocalteu试剂 北京索莱宝科技有限公司上述试剂均为分析纯。

CQ-250超声波清洗器 上海超声波仪器厂；JA5003电子天平 上海精密科学仪器有限公司；酶标仪 Thermo Science；HH·S21-8电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂；SIGMA 4K15离心机 北京博劢行仪器有限公司；GX-04粉碎机 上海高翔食品机械厂；DS63295,DU34526移液枪 北京DRAGON LAB。

1.2 实验方法

1.2.1 萌芽样品的制备 选籽粒饱满、无虫蛀、无霉烂、无残破的赤小豆,每10g赤小豆种子为1个实验组,进行萌芽,重复3次,按照最佳抗敏萌芽工艺萌芽0～6d,每天取出1个实验组赤小豆芽于干燥箱,50℃干燥24h,取出后,粉碎机粉碎,过80目筛,装入塑封袋,4℃保存待用。后续实验均采用该方法进行萌芽材料制备。

1.2.2 透明质酸酶抑制实验 精密称取赤小豆粉末1.0g,分别加入75%甲醇10mL,室温下超声提取30min,功率为100W。离心后,取上清液用缓冲液稀释后待下一步实验用。根据Elson-Morgan法[10],对样品进行抗敏活性的测定,每个样品三组平行,1%甘草酸二钾作为阳性对照。具体实验步骤如表1所示。

式中:A-对照溶液OD值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液)；B-对照空白溶液OD值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液)；C-试样溶液OD值；D-试样空白溶液OD值(用醋酸缓冲溶液代替酶液)。

1.2.3 总多酚含量测定 参照Taga等[11]方法进行改进。

1.2.3.1 对照品与供试品溶液的制备 对照品溶液精密称取0.10g没食子酸,用蒸馏水溶解、定容至100mL,此溶液质量浓度为1.0mg/mL。分别吸取上述溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL至10mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,所得没食子酸标准溶液的质量浓度分别为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL。供试品溶液精密称取萌芽0～6d赤小豆粉末各1.0g于试管中,加入75%甲醇10mL,超声提取30min,以12000r/min离心5min,取上清液,待测。

1.2.3.2 标准曲线的绘制 分别取不同浓度100μL没食子酸对照品于试管中,加入100μL甲醇和0.3%盐酸(体积之比为6∶4),加入2%的碳酸钠溶液2.0mL,混匀。静止2min加入50%的Folin-Ciocalteu试剂100μL,暗处理30min,分别测定在750nm下的吸光度,绘制标准曲线。

1.2.3.3 总多酚含量的测定 取100μL样液于试管中,按上述步骤操作,分别在750nm波长下测定吸光度,依据标准曲线计算总多酚含量。

1.2.4 总多糖含量测定 参照孙丽丽[12]等的方法进行改进。

1.2.4.1 对照品与供试品溶液的制备 对照品溶液精密称取葡萄糖100mg,加适量水溶解,转移至100mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得1.0mg/mL对照品溶液。精密吸取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中,加水稀释至5.0mL,摇匀,即得浓度为0、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL的对照品溶液。供试品溶液精密称取萌芽0～6d赤小豆萌芽粉末各1.0g于试管中,加入去离子水10mL,功率100W,45℃超声提取120min,以12000r/min离心5min,取上清液,待测。

1.2.4.2 标准曲线的绘制 分别取不同浓度葡萄糖溶液0.2mL放入试管中(另取0.2mL去离子水做空白对照)加入0.1mL 5%苯酚溶液,震荡混合均匀。再加入0.5mL浓硫酸,混匀5min后,封管沸水浴1h。最后,取出冷却至室温,使用紫外可见分光光度计在490nm处测吸光值。以吸光度值A为纵坐标,相应葡萄糖溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线。

1.2.4.3 总多糖含量的测定 取0.2mL样品溶液,按上述步骤操作,分别在490nm波长下测定吸光度,依据标准曲线计算总多糖含量。

1.2.5 总皂苷含量测定 参照闫婕[13]等的方法进行改进。

1.2.5.1 对照品与供试品溶液的制备 对照品溶液精密称定齐墩果酸对照品2.0mg,置10mL量瓶中,加75%甲醇超声溶解定容,制得每0.2mg/mL对照品溶液,冰箱冷藏待用。供试品溶液精密称取萌芽0～6d赤小豆萌芽粉末各1.0g于试管中,加入100%甲醇10mL,超声提取30min,以12000r/min离心5min,取上清液,待测。

1.2.5.2 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08mL,于具塞试管中,水浴挥干溶剂,各加入新配制的0.5%香草醛-冰醋酸0.2mL,高氯酸0.8mL,密塞摇匀,于70℃水浴中加热15min,取出立即流水冷却15min,摇匀。在550nm的波长处测定吸光度。以吸光度值A为纵坐标,相应齐墩果酸含量为横坐标,绘制标准曲线。

1.2.5.3 总皂苷含量测定 精密吸取供试品溶液0.04mL至具塞试管中,按上述步骤操作,以空白试剂为对照,在550nm的波长处测定吸光度,依据标准曲线计算总皂苷含量。

1.2.6 统计方法 每个实验重复3次,结果以x±s表示。数据结果采用SPSS v17.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 具有抗敏活性的最佳天数确定

赤小豆萌芽过程中,碳水化合物、蛋白质、多酚、有机酸等物质均在发生变化,其功效可能也在发生变化。通过抗敏功效评价实验,主要考查绿豆萌芽的抗敏活性及其随萌芽过程的变化规律。实验选择赤小豆萌芽0～6d提取物,进行抗敏功效检测。

赤小豆0～6d萌芽透明质酸酶抑制率如图1所示。萌芽第4d的抑制率最高,为90.67%±4.82%,并和其它萌芽天数呈极显著差异(p<0.01)。赤小豆萌芽过程中,抗敏活性呈先上升后下降的趋势,在第4d抗敏活性最佳。推测在萌芽初期(第0d),赤小豆体内的抗敏活性物质尚未被完全激活,随着萌芽过程的进行,抗敏活性物质种类和含量发生了变化,有关酶的活性也逐渐增强,在第4d达到顶峰,然而随着萌芽过程的继续进行,在萌芽后期,豆芽整体开始发蔫,生命机能收到衰减,有关酶的活力逐渐下降,导致赤小豆萌芽抗敏活性降低。

图1 不同萌芽天数(0～6d)赤小豆透明质酸酶抑制率(%)Fig.1 Hyaluronidase inhibition rate ofrice bean sprout extracts in different days 注:采用Duncan分析,不同字母表示显著差异性 (p<0.05,n=3)；阳性对照为1%甘草酸二钾。

2.2 不同萌发天数的赤小豆萌芽中总多酚含量测定

总多酚含量的标准曲线方程为:y=1.211x+0.012,R2=0.998(y值为吸光度,x值为加样浓度),结果的变化趋势如图2所示。多酚类物质是赤小豆萌芽次级代谢产物中重要的组成部分,以酚酸、黄酮类物质为代表,其显著的抗氧化、抗炎、抗敏功效越来越受到学者的关注。随着萌芽过程的进行,赤小豆萌芽中总多酚的含量逐渐增高,在第6d达到最高,为4.65mgGAE/g,与第0d形成极显著差异(p<0.01),推测经萌芽作用,赤小豆萌芽体内包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、黄酮合酶(IFS)在内的酶活性得到显著提升,从而生成更多的总多酚。从图2中可以看出,萌芽第3d至第4d过程中,总多酚含量上升了近20%,此结果与第4d为最佳抗敏活性单天相吻合,推测赤小豆萌芽抗敏活性的增强与总多酚含量的增加具有紧密联系。

图2 赤小豆萌芽总多酚含量Fig.2 The total polyphenol content of rice bean sprout注:采用Duncan分析,不同字母表示 显著差异性(p<0.05,n=3)。

2.3 不同萌发天数的赤小豆萌芽中总多糖含量测定

标准曲线方程为:y=8.395x+0.110,R2=0.999(y值为吸光度,x值为加样浓度),结果变化趋势如图3所示。多糖是赤小豆萌芽过程中重要的基础营养物质,不仅在能量代谢过程中起到重要作用,其所特有的药学特性和活力在抗敏、抗辐射、抗氧化防衰老、提高免疫力等应用中表现出优良的生物治疗作用。由图3可知,多糖含量在萌芽前期(0～4d)呈上升的趋势,并在第4d达到最高,为84.73mg/g,此结果与第4d为最佳抗敏活性单天相吻合,推测赤小豆萌芽抗敏活性与总多糖含量相关；随着萌芽过程的进行,在萌芽后期(4～6d)多糖含量逐渐下降,第6d多糖含量为37.44mg/g,仅为第4d的44%。从生命代谢的角度分析,萌芽初期赤小豆萌发需要多糖等营养物质的维持,因此在此时期多糖含量呈上升趋势；当萌芽进入稳定期和衰减期后,多糖逐渐分解为次生代谢产物,其含量也逐渐降低。

2.4 不同萌发天数的赤小豆萌芽中总皂苷含量测定

标准曲线方程为:y=51.98x-0.114,R2=0.999(y值为吸光度,x值为加样浓度),结果变化趋势如图4所示。赤小豆萌芽过程中皂苷类物质的含量变化总体变化不大,在第3d含量最高,为5.60±0.42mg/g,仅比萌芽初期(第0d为4.79±0.04)提高了17%。从定量结果分析,萌芽过程对赤小豆中总皂苷的含量影响不大,但不排除皂苷的种类发生了变化,可以在后期的研究中深入考察。

图3 赤小豆萌芽总多糖含量Fig.3 Total polysaccharide content of rice bean sprout注:采用Duncan分析,不同字母表示 显著差异性(p<0.05,n=3)。

图4 赤小豆萌芽总皂苷含量Fig.4 Total saponin content of rice bean sprout注:采用Duncan分析,不同字母表示 显著差异性(p<0.05,n=3)。

2.5 各成分含量与抗敏活性的相关性分析

通过SPSS 17.0 Spearman相关性分析,考察萌芽过程中各活性物质总含量的变化与抗敏活性变化之间的相关性,如图5所示,多酚类物质总含量与赤小豆萌芽抗敏活性的相关性最高。

图5 相关性分析标准曲线Fig.5 Standard curve of correlation analysis注:通过SPSS 17.0 Spearman相关性分析。

赤小豆萌芽中总多酚含量随萌芽过程的进行逐渐增多,总多糖的含量呈先降低后升高再降低的趋势,总皂苷含量随萌芽过程变化不明显,综上,结合透明质酸酶体外抑制率的变化趋势,采用SPSS 17.0 Spearman进行相关性分析,得出结论,三种活性物总含量的变化与抗敏活性并未呈显著相关性,但总多酚的相关度达到0.750,与赤小豆萌芽抗敏活性的相关性最高。

3 结果与讨论

以赤小豆萌芽为考查对象,利用抗敏活性评价实验、分析化学方法等手段,总结了赤小豆萌芽过程中抗敏活性的变化,研究了赤小豆萌芽活性物质随萌芽过程的变化规律。研究结果表明:以0～6d为萌芽周期,采用体外透明质酸酶抑制实验评价萌芽提取物抗敏活性,结果表明4d萌芽提取物抗敏活性较高。萌芽过程是提高赤小豆多酚类物质代谢水平的有效途径,并发现萌芽6d时总多酚含量相比于0d提高了145%。赤小豆萌芽多糖含量呈先升高后降低的趋势,总皂苷含量随萌芽进程变化不大。今后可深入研究萌芽过程中活性物质单体的种类和含量变化规律,通过代谢组学的方法分析赤小豆萌芽中起抗敏功效的关键物质。

本文首次对赤小豆萌芽的抗敏活性进行研究,结果证明萌芽作用对于植物药理活性的积极影响,并且多酚类成分为赤小豆中发挥抗敏功效的主要活性物质,本文研究结果为赤小豆萌芽作为功能食品及功能化妆品植物原料应用提供理论基础和科学依据。

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Study on the best sprouting day with anti-allergic activity of red beans and related active substances

LI Li,REN Han-kun,DONG Yin-mao*,SONG Li-ya,ZHANG Xiao-hui,LIU Chang

(Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

The anti-allergic activity of 0～6d of rice bean sprouts was determined by the hyaluronic acid enzyme inhibition experimentinvitro. The contents of total saponins,total polyphenols,and total polysaccharides in the sprouting process(0～6d)were also tested. The correlation between the active substances and anti-allergic activity was analyzed in the same time. The results showed that the 4thday of the rice bean sprouts had the highest anti-allergic activity. Different types of components showed different changes in the sprouting process. The results of correlation analysis showed that polyphenols were the active substances with anti-allergic activity.

rice bean;sprouts;anti-allergic;active substances

2014-06-16

李丽(1980-)，女，博士，讲师，研究方向：化妆品功效添加剂与配方工艺。

*通讯作者:董银卯(1963-)，男，博士，教授，研究方向：化妆品科学与技术。

北京市优秀人才培养资助D类(2012D005003000006)。

TS201.4

A

:1002-0306(2015)09-0335-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.064