SIRT1在有氧运动改善APOE-/-小鼠肝脏脂代谢异常中的作用研究

燕小妮



SIRT1在有氧运动改善APOE-/-小鼠肝脏脂代谢异常中的作用研究

燕小妮

目的：探讨SIRT1在有氧运动改善APOE-/-小鼠肝脏脂代谢异常中的作用。方法：16只雄性 C57BL/6J小鼠随机分为 C57BL/6J小鼠对照组(CC)和运动组(CE)，16只雄性APOE-/-小鼠随机分为APOE-/-小鼠对照组(AC)和运动组(AE)，每组8只。12周有氧运动干预后，通过病理学切片观察肝脏脂质积聚情况，检测小鼠肝脏SIRT1、LKB1、P-LKB1-ser428、AMPKα1、P-AMPKα1-Thr172和FAS蛋白表达量。结果：1)与CC组比较，AC组肝脏脂肪积聚增加，与AC组比较，AE组肝脏脂质积聚减少；2)与CC组比较，CE组SIRT1 (P<0.05)、P-LKB1-ser428(P<0.01)和P-AMPKα1-Thr172(P<0.01)含量明显升高，LKB1、AMPKα1和FAS没有明显变化(P>0.05)；3)与CC组比较，AC组SIRT1 (P<0.05)、P-LKB1-ser428(P<0.01)和P-AMPKα1-Thr172(P<0.01)表达明显降低，LKB1、AMPKα1和FAS没有明显变化(P>0.05)；4)与AC组比较，AE组SIRT1 (P<0.01)、P-LKB1-ser428(P<0.01)和P-AMPKα1-Thr172(P<0.01)表达明显升高，FAS表达明显降低(P<0.01)，LKB1和AMPKα1没有明显变化(P>0.05)。结论：12周有氧运动可能通过增加SIRT1表达，提高LKB1和AMPKα1活性，抑制FAS表达，改善APOE-/-小鼠肝脏脂代谢异常。

有氧运动；肝脏脂代谢；动脉粥样硬化；动物实验；鼠

肝脏是研究脂代谢的重要靶器官，是内源性和外源性脂代谢途径的交汇点和调节中心，能够合成和释放各种脂蛋白及脂代谢酶类，在维持脂代谢平衡中发挥着重要的作用[7]。APOE-/-小鼠是研究动脉粥样硬化的最常见模型，有研究发现，高脂喂养的APOE-/-小鼠肝脏有明显的脂质沉积，这可能影响肝细胞的正常形态和机能，诱发动脉粥样硬化肝脏脂肪性病变[1]。SIRT1是哺乳动物sir2同系物[9]，一种NAD依赖的脱乙酰化酶，参与糖脂代谢[4]和寿命的调节[10]。研究显示，2型糖尿病鼠附睾脂肪组织[17]和比目鱼肌[5]SIRT1表达水平下降，提示，SIRT1表达降低可能是某些慢性代谢疾病的病症之一。那么，动脉粥样硬化肝脏SIRT1表达是否降低？若SIRT1表达降低，是否与动脉粥样硬化肝脏脂代谢异常有关？有氧运动能否增加动脉粥样硬化肝脏SIRT1表达，SIRT1表达增加是否与运动改善肝脏脂代谢异常有关尚不明确。AMPK是细胞能量状态的感受因子，能够被其上游的LKB1、CaMkkB和TAK1激活。已有研究表明，高糖导致的肝脏AMPK功能受损，引起肝脏脂质积聚，而采用多酚类激活肝脏AMPK，减少了脂质沉积[11，15，19，21]。Zang等[23]对人肝细胞和1型糖尿病LDL-/-鼠进行研究发现，多酚类显著激活了肝脏AMPK，减少了脂质的沉积，减轻了糖尿病鼠的高脂血症和动脉粥样硬化。动脉粥样硬化肝脏AMPK的表达和活性是否降低，有氧运动能否影响AMPK的表达和活性，如果影响，是否与有氧运动影响SIRT1表达的变化有关，这些问题的答案尚不清楚。本研究的目的是通过观察12周有氧运动对APOE-/-小鼠肝脏SIRT1表达的影响，探讨SIRT1在有氧运动改善动脉粥样硬化肝脏脂代谢异常中的作用。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康SPF级7周龄APOE-/-小鼠和 C57BL/6J小鼠购自广东省医学实验动物中心[许可证号为SCXK(粤)2008-0002]，适应性喂养1周后[动物房温度为(25±1)℃，湿度为50%±5%，光照周期为12 h]，随机分为4组，C57BL/6J小鼠对照组(CC组)、C57BL/6J小鼠运动组(CE组)，APOE-/-小鼠对照组(AC组)、APOE-/-小鼠运动组(AE组)、每组8只。APOE-/-小鼠饲以高脂饲料(胆固醇含量为0.15%，脂肪含量为21%)。C57BL/6J小鼠饲以普通饲料。

1.2 运动方案

小鼠采用不负重游泳训练方式进行12周的有氧运动，游泳在白色的大水桶中进行，每桶4只动物，水深60 cm，水温(32±1)℃，第1周30 min/d，第2～12周60 min/d，每周训练6 d。

1.3 实验取材

干预停止36 h后利用10%水合氯醛(3.5 ml/kg bw)对小鼠进行麻醉后取相同部位的肝脏，将取出的肝脏一部分迅速置于液氮罐中备用测试蛋白指标，一部分置于10%甲醛溶液中固定48 h，用于制备肝脏组织病理切片。

1.4 主要实验仪器、试剂及材料

1.4.1 主要实验仪器

WO-9413B型凝胶成像系统(北京六一)；DYCZ-24DN型电泳仪(北京六一)；DYCZ-40D型电泳仪(转膜，北京六一)；AX-ⅡX射线摄影暗匣(广东粤华)；HM340E轮转式切片机(北京中昇天成科技有限公司)。

1.4.2 主要实验试剂及材料

PVDF膜(Milli pore)；GADPH酶标记二抗 (武汉博士德)；兔抗大鼠SIRT1(北京博奥森)、LKB1 (武汉博士德)、FAS(武汉博士德)、P-LKB1-ser428 (北京博奥森)、AMPKα1 (北京博奥森)、P-AMPKα1-Thr172(北京博奥森)多克隆抗体。

1.5 检测指标及方法

肝脏SIRT1、LKB1、FAS、P-LKB1-ser428、AMPKα1 、P-AMPKα1-Thr172蛋白表达采用Western-blot方法检测。Western-blot检测步骤为：SDS-PAGE电泳(5%浓缩胶90 V，12%分离胶110 V，不恒定电流，约1.5 h)。取分离胶将其放入电转膜仪转膜(90 V，30～90 min)，将蛋白转移到PVDF膜上，室温下用5%脱脂奶粉(用TBS稀释)室温封闭30 min，再4℃过夜，第2天室温平衡。不洗膜加一抗(1∶200，稀释液含2%的脱脂奶粉)孵育，4 ℃过夜。TBS洗膜4次，第1次15 min，后3次每次5 min。将膜在室温下与二抗(1∶5 000，稀释液含2%的脱脂奶粉)室温下孵育1 h，TBS漂洗。将PVDF膜上的TBS吸干，加入ECL化学发光试剂(试剂盒)，放入凝胶成像系统。

1.6 数据统计

2 实验结果与分析

2.1 不同组别小鼠肝脏HE染色图片

图1所示，肝脏石蜡切片经HE染色后，CC组和CE组小鼠肝脏都没有发现明显病理学改变。AC组小鼠肝小叶中血管充血，在中央静脉周围肝细胞脂肪变性明显，肝板中肝细胞有明显的点状坏死区域，周围有明显的炎性细胞浸润。AE组小鼠肝小叶结构基本正常，在肝板中有点状坏死区域，周围有炎性细胞浸润，肝细胞脂肪变性轻微。

图1 本研究不同组别小鼠肝脏HE染色图片示意图

2.2 不同组别小鼠肝脏SIRT1、LKB1 、P-LKB1-ser428、AMPKα1、P-AMPKα1-Thr172、FAS蛋白表达的比较

高脂饮食的APOE-/-小鼠肝脏SIRT1表达较C57BL/6J小鼠显著性降低(P<0.05)，运动训练明显升高C57BL/6J小鼠和APOE-/-小鼠肝脏SIRT1表达 (P<0.05，P<0.01，图3)。 高脂饮食的APOE-/-小鼠肝脏P-LKB1-ser428 表达较C57BL/6J小鼠明显降低(P<0.01)，运动干预明显升高C57BL/6J小鼠和APOE-/-小鼠肝脏P-LKB1-ser428 表达(P<0.01，图4)，不同组别小鼠肝脏LKB1表达没有明显变化(图5)。

图2 本研究不同组别小鼠肝脏蛋白表达图谱

图3 本研究不同组别小鼠SIRT1表达变化示意图

图4 本研究不同组别小鼠P-LKB1-ser428 表达变化示意图

图5 本研究不同组别小鼠LKB1表达变化示意图

高脂饮食的APOE-/-小鼠肝脏P-AMPKα1-Thr172表达显著降低(P<0.01)，运动干预明显升高肝脏P-AMPKα1-Thr172的表达 (P<0.01，图6)。不同组别小鼠肝脏AMPKα1表达没有显著性差异(P>0.05，图7)。高脂饮食的APOE-/-小鼠肝脏FAS表达没有明显变化，运动干预明显降低了APOE-/-小鼠肝脏FAS的表达(P<0.01，图8)。

图6 本研究不同组小鼠P-AMPKα1-Thr172表达变化示意图

图7 本研究不同组别小鼠AMPKα1表达变化示意图

图8 本研究不同组别小鼠FAS表达变化示意图

3 讨论

3.1 高脂喂养APOE-/-小鼠肝脏脂代谢异常

邹艳艳[7]研究发现，用高脂喂养的APOE-/-/LDLR-/-小鼠肝脏存在明显的脂质沉积，引起肝脏脂肪变性。当前研究也发现，利用高脂喂养的APOE-/-小鼠，肝脏存在明显的脂质积聚，脂肪细胞变性明显增加(图1，AC组)，有炎性细胞侵润。本实验检测了肝细胞中与脂质代谢有关的指标LKB1 、P-LKB1-ser428、AMPKα1 、P-AMPKα1-Thr172和FAS蛋白表达情况，发现高脂喂养的APOE-/-小鼠肝脏中LKB1、AMPKα1 和FAS没有明显变化，而P-LKB1-ser428和P-AMPKα1-Thr172的表达明显降低，提示，高脂喂养的APOE-/-小鼠肝脏脂代谢调节因子异常。先前研究表明，SIRT1与脂代谢存在明显相关，王军力等[6]研究发现，SIRT1可能通过促进PPARγ和aP2蛋白的表达改善2型糖尿病大鼠内脏脂肪组织脂代谢异常。有综述报道，用白藜芦醇干预高脂饮食喂养的大鼠，结果表明大鼠体重增加减慢，提示SIRT1能够抑制脂肪生成，加速脂肪分解[4]。本研究发现，高脂喂养的APOE-/-小鼠肝脏SIRT1表达明显降低，先前研究[5,19]指出，SIRT1在组织表达中降低可能是慢性代谢疾病的病理特征之一，提示，SIRT1表达下降可能是APOE-/-小鼠肝脏脂代谢异常的原因之一。

3.2 有氧运动对APOE-/-小鼠肝脏SIRT1和AMPKα1表达的影响

研究发现，耐力训练能够使正常大鼠[16，20]和糖尿病大鼠[5]比目鱼肌中SIRT1表达明显增加。有氧运动是否影响APOE-/-小鼠肝脏SIRT1的表达尚不明确。本研究发现，高脂喂养的APOE-/-小鼠肝脏SIRT1表达明显降低，经过12周的有氧运动明显提高了C57BL/6J小鼠和APOE-/-小鼠肝脏SIRT1表达。AMPK是细胞能量状态的感受因子，AMP/ATP含量增加能够导致AMPK的活化[21]。AMPK与脂代谢关系密切，有研究发现，在脂肪肝状态下AMPK的活性明显降低[22]，这与本研究的结果一致。已有研究发现，有氧运动能够增加胰岛素抵抗小鼠[3]和糖尿病大鼠[2]骨骼肌中AMPK的表达或活性。有研究表明，高糖血症诱导肝脏AMPKα1 功能异常导致了糖尿病动物肝脏脂质积聚，用白藜芦醇处理鼠的肝脏可以提高AMPKα1 的活性[8]。本研究发现，高脂喂养的APOE-/-小鼠肝脏AMPKα1 表达与C57BL/6J正常小鼠相比没有发生明显变化，但本实验进一步检测了AMPKα1 的磷酸化水平的变化，结果发现P-AMPKα1-Thr172的表达明显降低。此前，有氧运动能否影响肝细胞AMPKα1 和P-AMPKα1-Thr172的表达尚不明确。本研究发现，12周有氧运动对C57BL/6J小鼠和APOE-/-小鼠肝细胞AMPKα1的表达没有明显影响，但明显提高了两组小鼠P-AMPKα1-Thr172的表达，提示，有氧运动可以提高肝细胞AMPKα1 的活性。

3.3 SIRT1在有氧运动改善APOE-/-小鼠肝细胞脂质代谢异常的机制探讨

通过肝脏病理切片发现，12周有氧运动明显减少了APOE-/-小鼠肝脏脂肪积聚，脂肪变性明显减轻(图1，AE组)，说明有氧运动明显改善肝脏脂代谢异常。分子和生物化学证据已经证实了SIRT1和AMPK之间存在密切的功能联系。SIRT1能够调节衰老和衰老相关的疾病[12]，衰老伴随着AMPK活性降低，导致了脂代谢异常[17]。在脂代谢异常调节过程中，SIRT1和AMPK具有关键的调节作用[14]。有研究[23]进一步表明，SIRT1过度表达能够增加鼠肝细胞AMPKα1 的磷酸化水平，敲除SIRT1，AMPKα1 磷酸化水平降低，说明SIRT1是AMPKα1 信号通路的上游调节子。本研究最重要的研究任务是探讨SIRT1表达变化是否是有氧运动改善APOE-/-小鼠肝脏脂质代谢异常的关键调节子。本研究发现高脂喂养的APOE-/-小鼠肝脏SIRT1表达降低，尽管AMPKα1表达没有明显变化，但伴随着P-AMPKα1-Thr172表达减少，12周有氧运动明显增加了肝脏SIRT1表达，P-AMPKα1-Thr172表达也增加。

为了探讨SIRT1在有氧运动改善APOE-/-小鼠肝脏脂质代谢中作用的可能机理，本实验检测了AMPKα1 的上游调节子LKB1的表达及活性的变化和其下游与脂肪合成相关的FAS表达的变化。结果显示，高脂喂养的APOE-/-小鼠肝脏LKB1表达没有明显变化，12周有氧运动对C57BL/6J小鼠和APOE-/-小鼠肝脏LKB1的表达也没有明显影响。本研究进一步检测了P-LKB1-ser428的表达水平，结果发现，高脂喂养的APOE-/-小鼠肝脏P-LKB1-ser428水平明显下降，12周的有氧运动明显提高了C57BL/6J小鼠和APOE-/-小鼠肝脏P-LKB1-ser428的表达，说明有氧运动可以提高C57BL/6J小鼠和APOE-/-小鼠肝脏LKB1的活性。FAS能够促进脂肪的合成，在肥胖动物脂肪组织中FAS表达增加[18]。本研究发现，高脂喂养的APOE-/-小鼠肝脏FAS表达没有明显变化，12周有氧运动对C57BL/6J小鼠肝脏FAS的表达也没有明显影响，但是可以明显降低APOE-/-小鼠肝脏FAS的表达。有研究[13]发现，通过多酚类和SIRT1激活AMPK能够抑制FAS的脂肪合成能力，这与本研究的结果类似。因此，通过本实验研究发现，有氧运动可能通过增加APOE-/-小鼠肝脏SIRT1表达，激活LKB1和AMPKα1，抑制肝脏FAS的表达，减少了肝脏脂质的集聚。

4 结论

12周有氧运动可能通过SIRT1/LKB1/ AMPKα1/FAS信号途径改善小鼠肝脏脂代谢异常，SIRT1在调节过程中有非常关键的作用。

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Research on Effect of SIRT1 on Ameliorating Hepatic Lipid Metabolism Disorder of APOE-/-after Aerobic Exercise

YAN Xiao-ni

Objective: To observe the effect of SIRT1 of aerobic exercise on the improvement liver lipid metabolism in APOE-/-rats.Methods: 16 male C57BL/6J rats were randomly divided into control group (CC,n=8),exercise group (CE,n=8),16 male APOE-/-rats were randomly divided into control group (AC，n=8),exercise group (AE,n=8).After 12 weeks intervention,hepatic lipid accumulation were observed,Also the protein expression of SIRT1,LKB1,P-LKB1-ser428,AMPKα1,P-AMPKα1-Thr172 and FAS were determined in the liver.Results: 1) Compared with CC group,hepatic lipid accumulation increased significantly in the AC group,Compared with AC,lipid accumulation decreased significantly in the AE group.2) Compared with CC group,the content of SIRT1 (P<0.05),P-LKB1-ser428(P<0.01)and P-AMPKα1-Thr172(P<0.01)increased significantly,while the expression of LKB1,AMPKα1 and FAS (P>0.05)didn’t change significantly in the CE group.3) Compared with CC group,the expression of SIRT1 (P<0.05),P-LKB1-ser-428(P<0.01)and P-AMPKα1-Thr172(P<0.01)decreased significantly,while the expression of LKB1,AMPKα1and FAS(P>0.05)didn’t change significantly in the liver of AC group.4)Compared with AC group,the content of SIRT1 (P<0.01),P-LKB1-ser428(P<0.01)and P-AMPKα1-Thr172(P<0.01)increased significantly,while that of FAS(P<0.01)decreased significantly,and that of LKB1 and AMPKα1 didn’t change obviously(P>0.05).Conclusions: 12 weeks aerobic exercise may be through promoting the SIRT1,increasing LKB1 and AMPKα1 activity,inhibiting the expression of FAS,to ameliorate hepatic lipid metabolism disorder of APOE-/-rats.

aerobicexercise;hepaticlipidmetabolism;atherosclerosis；animalexperiment;rat

2015-03-30；

2015-07-30

燕小妮(1979-)，陕西户县人，讲师，硕士，主要研究方向为运动与健康，E-mail：634499211@qq.com。

怀化学院 体育系，湖南 怀化 418000 Huaihua University，Huaihua 418000，China.

1000-677X(2015)08-0040-05

10.16469/j.css.201508006

G804.7

A