侵染小苹果的苹果锈果类病毒的检测和全序列分析

郝 璐， 叶 婷， 王少杰， 国立耘， 范在丰， 周 涛

（中国农业大学植物病理学系，北京 100193）

研究简报

侵染小苹果的苹果锈果类病毒的检测和全序列分析

郝 璐， 叶 婷， 王少杰， 国立耘， 范在丰， 周 涛*

（中国农业大学植物病理学系，北京 100193）

小苹果是抗寒海棠类与大苹果的杂交后代，因耐寒能力强，口感好，被广泛用于嫁接与育种材料，是我国寒凉苹果产区宝贵的种质资源。苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid，ASSVd）侵染苹果后引起果实表面产生锈状斑、花脸、畸形等症状，严重降低果实品质和市场价值。2013年在调查苹果病毒病时发现北京市延庆县种植的小苹果表现出典型畸形症状，应用RT-PCR方法对其进行检测后经测序和序列分析表明，小苹果被苹果锈果类病毒侵染。克隆此分离物（ASSVd-YQ）全基因组序列，分析后得到其基因组全长为329个核苷酸，系统发育分析表明该分离物与来自不同国家和地区的ASSVd分离物间的进化关系极近。二级结构预测表明，该分离物的中央保守区与末端保守区与ASSVd参考序列相同。这是对侵染小苹果的ASSVd的首次检测和鉴定。

苹果锈果类病毒； 小苹果； 分子检测； 序列分析

苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid，ASSVd）为马铃薯纺锤块茎类病毒科（Pospiviroidae）苹果锈果类病毒属（Apscarviroid）代表成员，可以侵染苹果（Malus domesticaBorkh.）［1］、梨（PyruscommunisL.，P.amygdaliformisL.）［2］、桃［Prunus persica（L.）Batsch］［3］、杏（P.armeniacaL.）［4］和野樱桃（P.cerasoidesD.Don）［5］等植物。目前还没有发现传播介体，主要通过嫁接与自然根接传播。ASSVd基因组为单链环状RNA，长约330个核苷酸，具有5个功能区，能形成稳定的杆状和拟杆状的二级结构，具有一个中央保守区（CCR）和一个末端保守区（TCR）［6］。苹果锈果类病毒侵染苹果后在果实上引起锈果、花脸等症状，降低了果实的商品价值，是苹果上危害非常严重的一种类病毒，目前在中国［1］、希腊［2］、印度［5］、日本［7］等地都有发生。

小苹果为苹果属（MalusMill.）成员，主要分布在我国东三省和内蒙古东部，是大苹果与抗寒海棠类的杂交后代，因其单果重一般在50～100 g，故称为小苹果［8］。由于部分品种具有耐旱、耐寒等特性，被广泛用于苹果嫁接以及育种材料。2013年秋天在北京延庆调查苹果病毒病害时，发现部分小苹果果实表现出明显的畸形症状。采回发病果实，提取总RNA经RT-PCR检测和测序证实该果实被苹果锈果类病毒所侵染，这是对侵染小苹果的ASSVd的首次分离和鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

2013年10月在北京延庆县采集带有畸形症状的小苹果与健康的小苹果，整理后保存在4℃冰箱中。

RT-PCR所用的阳性对照为本实验室保存的含ASSVd基因的质粒。

总RNA提取试剂盒购自北京博迈德生物公司；d NTPs购自罗氏公司；M-MLV反转录酶和RNA酶抑制剂购自Promega公司；TaqDNA聚合酶购自北京奥赛博生物技术有限公司；琼脂糖购自BioWest；DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；T4 DNA连接酶、p MD18-T克隆载体、10×Loading Buffer购自大连宝生物公司；大肠杆菌Escherichia coliDH5α菌株由实验室保存。

1.2 方法

总RNA提取：取0.2 g果皮样品，按EASYspin植物RNA快速提取试剂盒说明书提取植物总RNA，于－20℃保存备用。

反转录：总RNA提取液3.5μL、随机引物1.0μL、5×M-MLV Buffer 4.0μL、dNTPs 1.0μL、RNA酶抑制剂0.5μL、M-MLV酶0.5μL，加DEPC处理水至20μL，42℃反应1 h，于－20℃保存备用。

PCR：参照郭瑞等报道的检测ASSVd的正向引物（5′-CCGGTGAGAAAGGAGCTGCCAGCA-3′）和反向引物（5′-CCTTCGCCTTCGTCGACGACGACAGGTGAGT-3′）［9］进行PCR，体系为cDNA 1.5μL、10×Buffer 2.5μL、dNTPs 0.5μL、正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、Taq酶0.25μL，加ddH2O至25μL。PCR反应条件为94℃预变性3 min；94℃变性30 s，67℃复性30 s，72℃延伸45 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物约330 bp，经1%琼脂糖凝胶电泳验证。

克隆测序：按DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，之后连接到p MD18-T克隆载体上，阳性克隆经验证后交由华大基因科技股份有限公司进行测序。将所得的序列经MEGA 5.1软件与GenBank中已报道的具有代表性的ASSVd苹果分离物序列进行比较分析。

2 结果与分析

图1 小苹果样品症状与苹果锈果类病毒RT-PCR检测结果Fig.1 Symptoms on small apple fruit and detection of ASSVd by RT-PCR

2.1 RT-PCR检测

以提取的表现畸形症状的小苹果果实（图1a左）与健康小苹果果实（图1a右）的总RNA为模板，利用检测ASSVd的引物进行RT-PCR扩增。与阳性对照相比，表现症状的样品获得了预期大小的目标条带，而健康样品则没有扩增出条带（图1b），表明带有畸形症状的小苹果已被ASSVd侵染。

2.2 序列测定与分析

将RT-PCR扩增得到的约330 bp的片段回收，克隆到p MD18-T载体并进行序列测定。结果表明，该分离物基因组由329个核苷酸组成，具有苹果锈果类病毒属中央保守结构序列。利用MEGA5.1软件构建邻接法（neighbor joining）系统发育树，以苹果凹果类病毒（Apple dimple fruit viroid，ADFVd）作为系统发育分析外群，1 000次循环计算系统树中节点的自举置信水平（图2）。可以看出，ASSVd小苹果分离物序列（标记为YQ）与来自不同国家和地区的ASSVd苹果分离物序列之间的亲缘关系极近，且与中国北京苹果分离物（HQ840722）和伊朗苹果分离物（HQ326094）处在同一分支上，进一步证明了在北京市延庆县发现的畸形小苹果被ASSVd侵染。

2.3 二级结构预测

将得到的ASSVd基因组全序列利用CLC RNA Workbench 4预测二级结构（图3），分析后发现ASSVd小苹果分离物的中央保守区（CCR）与末端保守区（TCR）与ASSVd其他分离物是完全一致的。

图2 ASSVd部分分离物系统发育树Fig.2 Phylogenetic relationship of some ASSVd isolates

图3 ASSVd小苹果分离物二级结构预测图Fig.3 Secondary structure prediction of ASSVd isolated from small apples

3 讨论

我国早些年在小苹果上发现了锈果病，但是危害不严重，并没有引起重视，随着‘国光’品种的引入和种植，锈果病逐渐引起了人们的重视［10］。迄今为止，ASSVd已在不同种类的果树上被检测到，如‘富士’苹果、杏和桃等，其寄主范围在扩展［1-5，9］。近几年通过调查和检测，我们发现ASSVd在我国苹果主产区发生率逐年提高，如不采取措施积极防控，将对我国苹果生产造成严重危害。在2013年的调查中，发现了果实畸形的小苹果，经检测和序列克隆分析，证实ASSVd侵染了在我国北方冷凉地区广泛种植的小苹果，这是对ASSVd侵染小苹果的首次检测和鉴定。本研究中ASSVd小苹果分离物的CCR和TCR与ASSVd其他分离物完全一致，有研究表明CCR和TCR与类病毒的复制密切相关［11-12］。小苹果由海棠［M.prunifolia（Will.）Borkh］和大苹果杂交而来，ASSVd能否侵染海棠还有待于调查和证实。

苹果锈果类病毒侵染苹果后引起的症状在不同的品种上有不同的表现，主要有锈果和花脸两种类型。本研究中ASSVd在小苹果上的症状主要表现为畸形和着色不匀，这可能是在小苹果这一特有品系上的表现，也可能是与其他病毒复合侵染引起的。

我国东北地区气候寒冷，耐寒性极强的小苹果在当地的苹果生产与育种中都占有非常重要的地位，生产面积约10万hm2［8］。鉴于ASSVd的严重危害性和传播性，应密切关注其在小苹果栽培生产中的危害，在今后的病害流行研究、防治与种质资源保护中都应该给予重视。

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Detection and full sequence analysis ofApple scar skin viroidin small apples

Hao Lu， Ye Ting， Wang Shaojie， Guo Liyun， Fan Zaifeng， Zhou Tao
（Department of Plant Pathology，China Agricultural University，Beijing100193，China）

Small apples are hybrid generations of cold-resistant crabapple cultivars and big apples.Because of their strong endurance under cold and good taste，small apples are widely used as grafting and breeding materials，and are precious germplasm resources in cold regions in our country.Apple scar skin viroid（ASSVd）causes serious damage on apple fruits and huge economic loss.During a survey of apple virus disease in 2013，some small apples with typical malformation symptoms were found in Yanqing County，Beijing.RT-PCR and sequencing showed that those small apples were infected by ASSVd.The full nucleotide sequence of this isolate（ASSVd-YQ）comprises 329 nucleotides.Phylogenetic analysis showed this isolate had close evolution relationship with other isolates reported in different countries and regions.Secondary structure prediction showed that the central conserved region（CCR）and terminal conserved region（TCR）were identical to the reported ASSVd reference sequence.This is the first isolation and identification of ASSVd in small apples.

Apple scar skin viroid； small apples； molecular detection； sequence analysis

S 432.1

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.024

2014 01 02

2014 04 09

国家现代苹果产业技术体系（CARS－28）；公益性行业（农业）科研专项（201203076－02）

*通信作者 E-mail：taozhoucau@cau.edu.cn