复方益节健片中淫羊藿苷和丹参酮ⅡA的TLC鉴别和HPLC含量测定

★ 陈阿虹 柳庆龙 孙照霞

(1.福建中医药大学药学院 福州 350122； 2.福建中医药大学福建中西医结合研究院 福州 350122)



复方益节健片中淫羊藿苷和丹参酮ⅡA的TLC鉴别和HPLC含量测定

★ 陈阿虹1柳庆龙1孙照霞1

(1.福建中医药大学药学院 福州 350122； 2.福建中医药大学福建中西医结合研究院 福州 350122)

目的：建立复方益节健片中淫羊藿苷和丹参酮ⅡA的TLC鉴别和HPLC含量测定方法，为完善复方益节健片质量标准提供参考。方法：采用薄层色谱法对淫羊藿和丹参进行定性鉴别；采用高效液相色谱法测定处方中的淫羊藿苷和丹参酮ⅡA的含量。色谱条件：采用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为水-乙腈，梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为270 nm；进样量为10 μL。结果：淫羊藿苷和丹参酮ⅡA分别在10～50 μg/mL(r=0.999 8,n=5)和4～20 μg/mL(r=0.999 8,n=5)范围内线性关系良好，平均回收率分别为97.82%和96.77%，RSD分别为1.14和1.80。结论：本方法专属性、重复性好，可用于复方益节健片的质量控制。

复方益节健片；薄层色谱法；高效液相色谱法；淫羊藿；丹参

复方益节健片是由淫羊藿、熟地黄、牛膝、丹参等中药材提取加工而成，并添加生物碳酸钙、酪蛋白磷酸肽等为原料，是一种适宜中老年人服用的保健品，具有增加骨密度的作用。虽然本品以中药为原料，安全且无碍，但中药药效的发挥是多组分共同作用的结果，有效成分的含量会直接影响药物的效果，建立合理的质量标准，能更好的提高药物的质量。淫羊藿为方中的君药，研究表明其指标性成分淫羊藿苷能够提高骨密度，预防骨质疏松[1]。方中的丹参则具有活血痛经的功效，其有效成分为丹参酮ⅡA[2]。参考文献报道，笔者以淫羊藿苷和丹参酮ⅡA为指标建立定性定量方法，以期完善复方益节健片的质量标准。

1 仪器与试药

日本岛津LC-20A高效液相色谱(四元泵、柱温箱、自动进样器、DAD检测器、日本岛津公司)；ZF-I型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)；FA-1004型电子天平(上海天平仪器厂)；硅胶G、H薄层板(青岛海洋化工厂)；数控超声波清洗器(KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司)。

复方益节健片(片仔癀药业股份有限公司提供，批号：140217,140218,131212)；淫羊藿苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110737-201012)；丹参酮ⅡA(中国食品药品检定研究院，批号：110766-200518)。

乙腈(色谱纯，美国默克公司)；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 复方益节健片的TLC鉴别

2.1.1 淫羊藿的TLC鉴别[3]取本品10片，除去包衣，研细，取约1 g，置于锥形瓶中，加入乙醇10 mL超声20 min，滤过，滤液蒸干，用适量的乙醇溶解，作为供试品溶液。取淫羊藿苷对照品，用乙醇溶解，配制成1 mg/mL的对照品溶液。另按处方配比，取缺淫羊藿的其他各味药，制成淫羊藿阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10:1:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点；喷以5% AlCl3溶液，再置紫外光灯(365 nm)下检视，显相同的橙红色荧光斑点，阴性对照无干扰。结果见图1。

1-3.供试品；4.淫羊藿苷；5.阴性对照

2.1.2 丹参的TLC鉴别[3]取本品10片，除去包衣，研细，取约1 g，置于锥形瓶中，加乙醚20 mL，超声20 min，滤过，滤液挥干，残渣用适量的乙酸乙酯溶解，作为供试品溶液。取丹参酮ⅡA对照品，加乙酸乙酯配置成2 mg/mL的对照品溶液。另按处方配比，取缺丹参的其他各味药制成丹参阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4:1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点，且阴性对照无干扰。结果见图2。

2.2 HPLC测定复方益节健片中2种有效成分的含量

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-SP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～13 min时，B为28%，13～23 min时，B由28～85%，23～35 min时，B为85%；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：270 nm；进样量：10 μL。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500。专属性试验符合要求，结果见图3。

1-3.供试品；4.丹参酮ⅡA；5.阴性对照

1.淫羊藿苷；2.丹参酮ⅡA；A.复方益节健片；

B.混合对照品；C.阴性样品

图3 HPLC色谱图

2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别称取干燥至恒重的淫羊藿苷和丹参酮ⅡA对照品5.0 mg和2.0 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含淫羊藿苷0.10 mg和丹参酮ⅡA0.040 mg的混合对照品储备液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品10片，除去包衣，研细，精密称定，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，混匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照品溶液的制备 按本品处方工艺制备，取除淫羊藿和丹参外的阴性样品，按照“2.2.3”项下方法处理，制备阴性对照溶液。

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 标准曲线的制备 取“2.2.2”项下的混合对照品溶液进行倍比稀释，配制成不同浓度的对照品溶液，按上述色谱条件，注入液相色谱仪中，测定各自峰面积。以2种对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，各自计算回归方程。淫羊藿苷：Y= 2.19×105X- 26.43，r=0.999 8；丹参酮ⅡA：Y= 3.77×105X+ 36.82，r=0.999 8。结果表明，淫羊藿苷在10～50 μg/mL、丹参酮ⅡA在4～20 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5.2 精密度试验 取同一对照品溶液，按照上述色谱条件，连续重复进样6次，计算各峰面积值的RSD值分别为淫羊藿苷1.12%、丹参酮ⅡA0.83%，结果表明精密度良好。

2.2.5.3 重复性试验 取同一批样品(批号：140217)，共6份，按照“2.2.3”项下方法处理，按照上述色谱条件分析，结果样品中淫羊藿苷平均含量4.80 mg/g，RSD=1.77%；丹参酮ⅡA平均含量0.53 mg/g，RSD=0.86%。表明方法重复性良好。

2.2.5.4 稳定性试验 取同一样品，按照“2.2.3”项下方法处理，分别在制备后0，2，4，8，12，24 h进样，测定峰面积，考察峰面积变化情况。淫羊藿苷RSD为0.98%，丹参酮ⅡARSD为2.23%，表明2个成分至少在24 h内稳定。

2.2.5.5 加样回收率试验 取已知淫羊藿和丹参酮ⅡA含量的同一批样品(批号：140217)，共6份，约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入各对照品溶液适量，按照“2.2.3”项下方法处理，照上述色谱条件进行测定，计算淫羊藿苷和丹参酮ⅡA加样回收率，结果见表1。

2.2.6 样品含量测定 取不同批号样品，按上述供试品溶液的制备方法和色谱条件进行含量测定，平行6份进样分析。计算淫羊藿苷和丹参酮ⅡA的含量，结果见表2。

表1 2种成分回收率的测定结果

表2 淫羊藿和丹参酮ⅡA含量(n=3)

3 讨论

骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的代谢性骨病，常见于中老年人，且其发病率呈逐年增加的趋势[4]。复方益节健片能够明显的提高骨密度，缓解骨痛，可用于预防骨质疏松症。但目前，复方益节健片的质量标准尚未完善。因此，本文建立了复方益节健片的定性定量研究方法。

前期研究中已建立了复方益节健片中淫羊藿苷的含量测定，并确定了提取工艺为50%甲醇超声提取30 min。本试验中，考虑到丹参酮ⅡA的不稳定性，为了更好地对淫羊藿苷和丹参酮ⅡA进行定量研究，对提取方法，提取溶剂，提取时间做了综合的考量，最后确定采用甲醇超声提取30 min。

在前期工作及相关文献的基础上[6]，曾考察甲醇-水系统和乙腈-水系统的不同梯度为流动相，并且调节不同的流速和柱温。最后采用乙腈-水系统进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃。在此条件下，淫羊藿苷和丹参酮ⅡA样品的相对保留时间分别在11.51 min和30.42 min，均达到基线分离的要求。综上，本方法简便可行、重复性好，适用于复方益节健片的质量控制。

[1]成魁,葛宝丰,甄平,等. 口服淫羊藿苷可提高大鼠的峰值骨密度和骨质量[J].中国骨质疏松杂志,2014,20(2):120-124.

[2]谢诗涓,李健,熊莺. 丹参酮ⅡA对人股骨头成骨细胞金属蛋白酶表达的影响[J]. 中国骨质疏松杂志,2012,18(8):685-689.

[3]国家药典委员会. 中华人民共和国药典·一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010.

[4]白莉萍. 阿仑膦酸钠对糖尿病合并骨质疏松骨密度的作用[J]. 中国药物与临床,2014,14(7):991-993.

[5]杨洪元. 保元排毒丸中丹参酮ⅡA的含量测定及稳定性研究[J]. 中医学报,2013,28(12):1851-1853.

[6]李春. HPLC法测定肌瘤化消颗粒中淫羊藿苷和丹参酮ⅡA[J]. 现代药物与临床,2014,29(7):742-744.

福建省科技厅高校产学合作重大项目(2013Y4005)。

徐伟(1975—)，男，副教授。E-mail:xwfjtcm@sina.com。

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2015-02- 10)编辑：曾文雪