肿瘤免疫治疗与化疗的协同效应研究现状

黄纯综述，李凯审校

（天津医科大学肿瘤医院肺部肿瘤内科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津300060）

肿瘤免疫治疗由于其较低的毒性和较高的特异性，长期以来一直被认为是一种很有吸引力的治疗手段[1]，其中肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞（CTL）是最为理想的免疫效应细胞[2]。肿瘤免疫治疗主要包括细胞因子、单克隆抗体、肿瘤疫苗[3]及细胞过继免疫治疗等。实体肿瘤免疫主要通过CTL、自然杀伤细胞（NK）、自然杀伤T细胞（NKT）等介导杀伤效应。树突细胞（DCs）在协调上述细胞的过程中扮演重要角色。而肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、调节性T细胞（Treg）、骨髓来源的抑制性细胞（MDSC）又形成了一个抑制免疫效应的网络，在免疫抑制因素存在时如何有效诱导抗肿瘤T细胞效应一直备受关注。然而，单一CTL免疫治疗在多项临床试验中未能展示其突出的临床疗效[4]。化疗是恶性肿瘤传统的治疗方法之一，它能够杀死增殖活跃的肿瘤细胞，但化疗通常对免疫系统有抑制作用[5]。因此，CTL联合化疗这种治疗模式一直被多数学者认为不甚合理。近年来的临床研究表明，免疫治疗联合化疗能够使部分患者临床获益，所以联合治疗这种模式再次受到重视[6]。然而，二者联用产生协同效应的具体机制仍不甚清楚。

1 化疗对免疫系统的作用

大多数化疗药物能够杀死快速分裂细胞，包括免疫系统中的细胞。强烈的化疗可致淋巴细胞减少及循环T细胞比例下降[7]。有证据表明，经典化疗方法可降低T细胞功能，最终降低抗肿瘤免疫效应[7]。Spisek等[8]的研究表明，蛋白酶体抑制剂硼替佐米可诱导细胞表面的HSP90表达。后者（HSPs）是一个危险信号，对DCs来说其意味着向外传递了“吃我”的信息[9]。但非细胞毒剂量的化疗药物，如紫杉醇、阿霉素、丝裂霉素C和氨甲喋呤等，却以一种IL-12依赖的自分泌模式增加了肿瘤抗原的递呈[10]。DCs经长春新碱处理之后历经成熟，其诱导CD8+T细胞反应的能力明显增强[11]。化疗也通过直接影响肿瘤细胞的方式诱导抗肿瘤反应，使得致免疫原性细胞死亡[12]，并可使肿瘤细胞更易被CTL杀伤；有数据显示5-Fu、CPT-11和DDP可以增加结肠癌细胞系SW480被T细胞杀伤的敏感性[13]。化疗还可去除MDSC和调节性T细胞而消减肿瘤微环境中的免疫抑制因素[14]。

免疫原性是指能够刺激机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的能力，化疗药物可通过诸多细胞反应来增强肿瘤细胞的免疫原性。用蒽环类化疗药物处理肿瘤细胞后，细胞内的钙网蛋白可转运到细胞表面来介导免疫反应，促使树突状细胞激发肿瘤特异性的T细胞免疫反应[15]。化疗药物还可通过调节肿瘤抗原表达的质或量，来改变肿瘤细胞的免疫原性。Ramakrishnan等[16]通过激光共聚焦显微镜发现化疗药物可以诱导B16F10、U266肿瘤细胞发生自噬。化疗药物不仅可以直接杀死肿瘤细胞，也可以通过诱发自噬导致肿瘤细胞的应激和死亡，而后者更加具有免疫原性继而激发机体免疫反应[17]。因此，那些处于应激状态并即将死亡的肿瘤细胞可以被看作是一种“治疗性疫苗”来调节机体免疫进而控制残余的肿瘤细胞[18]。Michaud等[19]指出，自噬对于化疗诱导的细胞死亡不是必要的，但对于增加免疫原性是必要的。化疗后那些有能力发生自噬的肿瘤能够诱导树突细胞和T细胞进入肿瘤床。

综上，化疗可增加肿瘤抗原的递呈。细胞毒药物能通过调节全身免疫抑制因素或降低某些细胞数量而导致抗原特异性T细胞的扩增。化疗药物可通过多种途径来增强肿瘤细胞的免疫原性。较低的非细胞毒剂量的化疗药物可改善机体免疫功能，但传统剂量的化疗药物是否可以增加免疫治疗效应尚存争议。

2 免疫治疗联合化疗是否可产生协同效应

免疫治疗不仅能重建人体免疫系统，保护患者机体平衡不受破坏，还能有效克服化疗耐药等难题。例如，干扰素联合化疗治疗慢性粒细胞白血病可减低化疗药物的剂量。化疗和不同肿瘤疫苗的联合使用可有效提高临床有效率[20]。胰腺癌患者注射DC疫苗后再用吉西他滨进行化疗，可显著降低肿瘤的生长并提高胰腺癌患者的生存率[21]。用抗CTLA-4的单克隆抗体联合化疗治疗小细胞肺癌的II期临床试验中，相比单独化疗，联合治疗显示出更好的抗肿瘤效果[22]。

在前期工作中[16,23]，本研究团队以B16F10恶性黑色素瘤小鼠模型作为研究对象，选用从Pmel-1转基因小鼠脾脏分离获得的Pmel T细胞进行免疫治疗（其可以识别B16F10细胞上gp100抗原表位），以紫杉醇12.5mg/kg（非细胞毒剂量）进行化疗。结果表明，单独给予T细胞或紫杉醇虽可抑制肿瘤生长，但停止治疗后1周又继续增长；两者联合治疗的抗肿瘤效应显著增强。在第2个模型中，我们将表达Neu癌基因的TUBO乳腺癌细胞接种至BALB/c小鼠皮下，以负载Neu来源肽的DC疫苗进行免疫治疗。同样，单一治疗作用微弱，而DC疫苗联合紫杉醇的抗肿瘤效果显著。在第3个模型中，笔者将表达鸡OVA的EG-7淋巴瘤细胞接种至小鼠皮下，使用OVA来源的肽（SINFEKL）免疫小鼠，从小鼠脾脏分离纯化获得T细胞进行过继性免疫治疗。T细胞或紫杉醇单独应用均使肿瘤轻微缩小，二者联合显著增强抗肿瘤效应。

3 免疫治疗联合化疗产生协同效应的分子机制

给小鼠注射紫杉醇后，CTL穿透肿瘤实质的能力增加。这可能归咎于化疗可破坏肿瘤间质细胞。体外实验结果显示，给予非细胞毒剂量的化疗药物可以使肿瘤细胞对CTL介导的杀伤作用更加敏感。尽管紫杉醇、阿霉素、顺铂3种药物作用机制不甚相同，但它们均可诱导上述现象。

CTL可通过包括 IFN-γ、Fas/FasL[24]以及穿孔素/颗粒酶B[25]等机制发挥细胞毒作用。IFN-γ能杀伤肿瘤细胞，但其在诱导程序性死亡的过程中扮演何种角色尚不得知。在体内肿瘤模型中，NK和NKT细胞能够产生IFN-γ对抗肿瘤生长，但只能引发有限的肿瘤细胞死亡。IFN-γ可促进某些细胞因子如CXCL10产生而帮助在肿瘤部位募集免疫细胞，还可与IL-12一起通过活性氧簇和氮的中间产物在凋亡过程中发挥作用[26]。IFN-γ通过上调HT29肿瘤细胞表面Fas和Fas L而诱导凋亡[27]。Kiefer等[28]认为IFN-γ能够通过直接或是间接的方式诱导凋亡相关基因，调控不依赖p53的凋亡途径。在前期研究中，本研究团队试图证实联合治疗效果与IFN-γ诱导的凋亡存在相关，但结果显示IFN-γ的水平在对照组和治疗组之间没有显著性差异。

Fas通路是广为人知的诱导凋亡通路，其涉及效应细胞表面上的FasL和靶细胞表面上的Fas受体（CD95）。FasL通过三聚作用结合并激活受体。被激活的受体可以募集一些衔接分子，如Fas相关的死亡受体蛋白（FADD），从而进一步激活procaspase8。Caspase 8通过BID或是细胞色素C途径激活caspase 3，最终导致DNA断裂[29]。本研究团队评估了3种药物（紫杉醇、顺铂、阿霉素）治疗后肿瘤细胞表面上Fas的表达和脾细胞表面上FasL的表达后发现，以上药物均未改变Fas或是FasL的表达，却显著增加了颗粒酶B对靶细胞膜的通透性。所有尝试的细胞毒药物也都增加了人肿瘤细胞系细胞内颗粒酶B的水平[23]。除此之外，抑制颗粒酶B的活性降低了紫杉醇对CTL诱导的凋亡作用，从而证实了化疗联合CTL的协同作用是通过上述关键机制发挥作用的[23]。

CTL和NK细胞通常利用接触依赖性机制杀伤恶性肿瘤细胞。当效应细胞接触靶细胞之后，CTL释放生孔蛋白、穿孔素和丝氨酸激酶的一个家族成员（颗粒酶）[30-31]。颗粒酶B是颗粒酶家族中研究最多也是最重要的成员。颗粒酶B既可以诱导caspase依赖，也可诱导caspase非依赖的细胞死亡。颗粒酶B可以间接的通过BCL-2家族中的促凋亡成员BH3结构域凋亡诱导蛋白（BID）进而引发caspase激活[32-33]。此外，其也可以通过不依赖BID的途径诱导细胞凋亡[34]。

最初人们认为穿孔素扮演一个管道角色，通过将自己插入细胞膜而产生一个通道，使颗粒酶B被动地穿过[35]。但最近的研究表明其并非是靶细胞摄取颗粒酶B的唯一机制。有证据显示颗粒酶B穿入细胞可以被受体介导的细胞内吞作用控制[36]。其中介导颗粒酶B摄入细胞最主要的受体之一是甘露糖6磷酸受体（M6PR）[37]。人类的M6PR基因定位于6q26,该基因编码的M6PR蛋白是单链跨膜受体，在所有的组织细胞中都表达，90%位于细胞内，其余分布在细胞膜。M6PR可与两种类型的配体结合，一种是胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor II，IGF-II），另一种是含有6-磷酸甘露糖糖基的蛋白质。该受体的基本功能是在细胞内将磷酸甘露糖酰糖蛋白从高尔基体运到溶酶体，以及将包括IGF-II在内的细胞外配体内化并转运至到溶酶体中进行降解。在前期体外研究中本研究团队发现紫杉醇、顺铂、阿霉素均可以上调肿瘤细胞表面M6PR，同时颗粒酶B也被更多摄入肿瘤细胞[16]。因此推断化疗通过上调肿瘤细胞表面M6PR增强了CTL免疫治疗的效果。应用特异性M6PR shRNA下调肿瘤细胞M6PR的表达导致经紫杉醇预处理的肿瘤细胞摄取颗粒酶B显著下降，表明上调M6PR能够使肿瘤细胞对CTL的细胞毒作用更加敏感[16]。笔者使用紫杉醇、阿霉素预处理CTL 18 h，并测量CTL对EL-4肿瘤靶细胞的细胞溶解活性。经紫杉醇预处理后，CTL的特异性细胞毒作用没有增强，阿霉素反而使CTL作用减弱。但是，当CTL和肿瘤细胞同时经过紫杉醇处理后，细胞毒效应明显增加。这提示化疗不能直接增强CTL的细胞毒作用。随后，应用缺乏穿孔素表达的CTL来处理肿瘤靶细胞，结果发现这些CTL不能杀死未经化疗预处理的靶细胞，但可以有效地杀死经过化疗处理过的肿瘤细胞。以上结果表明，化疗可通过上调肿瘤细胞M6PR调节颗粒酶B的摄取并降低了细胞毒杀伤过程对穿孔素的需求。

4 结语

恶性肿瘤的免疫治疗联合化疗可以产生协同效应。化疗药物可通过多种途径来增强肿瘤细胞的免疫原性。非细胞毒剂量的化疗可增加肿瘤抗原的递呈，还可下调MDSC、Treg等免疫抑制因素进而导致抗原特异性T细胞的扩增。目前，免疫治疗与化疗协同效应的分子机制仍有很多盲点。通过前期研究，本研究团队提出了一个新的机制来阐述CTL与化疗在肿瘤治疗中的协同作用。在单一免疫治疗中，由肿瘤疫苗诱导产生或是体外诱导培养并输入患者的CTL能穿透进入肿瘤实质并接触到表达抗原的肿瘤细胞，CTL被激活后释放穿孔素和颗粒酶B而杀伤肿瘤细胞。因此，免疫治疗的效应由渗透进入肿瘤实质内的CTL以及表达特异性抗原的肿瘤细胞的数量共同决定。这个免疫激发的过程还与肿瘤微环境中的诸多免疫抑制细胞相拮抗，单一免疫治疗后通常只能在有限的患者中检测到抗肿瘤免疫反应。化疗可破坏肿瘤基质从而导致更多的CTL穿透进入肿瘤实质，也可抑制肿瘤微环境中的负性调控网络进而发挥免疫调节作用。更重要的是，化疗上调了肿瘤细胞表面M6PR的表达，随后被激活的CTL所释放出来的颗粒酶B可以被大量的临近的肿瘤细胞所摄取。因此，相对较少数量的CTL可以导致大量肿瘤细胞凋亡。该机制仍需要在动物模型以及肿瘤患者中进一步验证。

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