流感嗜血杆菌自身因子在生物膜形成过程中的作用

高雪，尚小领，张玉妥△

流感嗜血杆菌自身因子在生物膜形成过程中的作用

高雪1，尚小领2，张玉妥1△

流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae，Hi）是人体上呼吸道常见寄生菌，当机体免疫力低下时，可引起发病；当Hi在感染部位形成生物膜（Biofilm，BF）后，对抗生素的敏感性下降，常引起疾病慢性化，使临床治疗变得棘手。近年来，Hi BF的致病性和BF形成相关自身因子已渐渐成为临床和基础研究学者关注的热点，本文就近年来国内外的报道综述如下。

嗜血菌，流感；生物膜；药物耐受性；综述

流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae，Hi）是革兰阴性菌，常寄居在人上呼吸道，在人体免疫力低下时可引起感染，是一种常见的条件致病菌。细菌生物膜（Biofilm，BF）是具有一定空间构型的细菌群体，由被覆细菌、脂多糖、基质蛋白、核酸等成分组成。已经证实，很多临床疾病和Hi BF有关，如慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性发作［1］、囊性肺纤维化（CF）［2］、慢性鼻-鼻窦炎（CRS）［3-4］、分泌性中耳炎（OMA）［5］、腺样体肥大［6-7］等。Hi BF的形成受其自身多种因素的参与和影响，主要包括以下几点。

1　菌毛（pili）

Pili是Hi重要的抗原和毒力因子，在BF形成早期有黏附和定植作用。较早的研究发现，pili抗原丢失的变异株生产BF的能力仅为亲本株的1/4～1/3［8］。Ⅳ型菌毛（TypeⅣpili，Tfp）是在Hi、奈瑟球菌、肠致病大肠杆菌等革兰阴性菌细胞端部的短纤毛，由呈螺旋形排列的蛋白亚基构成。Tfp和细菌的蹭行运动有关，能介导细菌吸附到宿主上皮细胞，引发后续生理活动。用荧光素标记的Tfp特异性抗体孵育Hi BF，激光共聚焦显微镜观察发现，Tfp在BF内部呈纤细的的小桥梁结构，构成菌体之间输送营养物质的“水通道”，在细菌之间起连接和运输作用［9］。Tfp由pilABCD、comABCDEF两个操纵子共同调控编码。PilA是Tfp中主要的蛋白亚基，与该蛋白的功能关系密切。一个PilA缺陷的突变株，其形成BF的生物量是其亲本株的1/2，而重组基因补足株生物量是其亲本株的3/4；PilA和细菌的黏附能力关系密切［10］。PilB 和Tfp三磷酸腺苷酶具有同源性，PilC是普通分泌途径跨膜蛋白（general secretory pathway transmembrane protein，Gsp）家族的细胞质膜蛋白，PilD和Ⅳ型前菌毛蛋白同源。ComE是一种分泌素，ComA、ComB、ComC、ComD则与ComE分泌素活性的稳定性有关，ComF的功能还不清楚；pil和com基因簇中每个基因的缺失突变都会引起BF厚度、密度以及总生物量的减少，pilA和comC两个基因的影响最显著［11］。

2　蛋白质

2.1Hi的氧化-还原系统Hi的氧化-还原系统不完善，过氧化物酶-谷氧还原蛋白（peroxiredoxin-glutaredoxin，PGdx）属于Hi硫醇依赖过氧化物酶家族，包含一个N末端过氧化物酶区和一个C末端谷氧还原蛋白区，具有感应、对抗环境氧化压力、监管细胞凋亡等功能。缺失PGdx蛋白的变异株形成BF的生物量比其亲本株减少25%～50%［12］。

2.2Hi敏感抗菌肽（sap）细菌为了生存，必须从宿主获取生存所需的铁和血红素。Sap除了能抵抗宿主免疫作用，还可以调节亚铁血红素的转运。sapABCDFZ编码6个蛋白，SapA是一个胞质底物结合蛋白，SapB和SapC是两个跨膜通透性酶蛋白，SapD和SapF是两个和内膜基质转运相关的腺苷亚基（ATPase subunits），SapZ作用尚不明确。SapF在Hi对亚铁血红素的获取与细胞膜内转运和调解中有着关键作用，SapF缺失变异株在南美栗鼠中耳和鼻腔形成BF的黏附性下降［13］。

2.3P6蛋白是Hi高度保守的细胞外膜蛋白（outer membrane protein，OMP），其分子质量为16 ku。在动物实验中，基于慢性中耳炎是一种BF感染性疾病的认识，用纯化后的P6蛋白免疫动物，发现免疫后动物中耳炎的发病率并无明显的下降，因此推测，P6蛋白在Hi BF形成过程的作用并不是很重要［8，14］。

2.4Haps蛋白是Hi的一种表面黏附分子，属于自我转运蛋白家族，具有丝氨酸（Ser，S）活性，能介导Hi吸附于人呼吸道上皮细胞，在BF形成前期，可以促使Hi聚集和微菌落形成；Haps蛋白还能与细菌胞外基质中的黏连蛋白、胶原等结合，胞外基质在细菌群体与外界环境异物（机体植入物、组织细胞等）之间起黏附作用［14］。

2.5HWM1/2蛋白HWM1/2蛋白能够和红细胞表面受体发生凝集反应，调节细菌与上皮细胞的黏附，还可以绑定细胞表面胞外糖蛋白，与邻近细菌形成一种稳定的交联结构，维持BF内菌体之间的连接［14］。

2.6IgA1蛋白酶是一种水解酶，可以水解人免疫球蛋白IgA1铰链区多肽序列TPPTPSPSTPPTPSPS，为细菌提供氨基酸；它还参与激肤释放酶-激肤系统的级联反应，直接或间接降解宿主蛋白质，引起组织破坏。也可通过降解宿主免疫球蛋白及影响补体因子等途径削弱宿主防御功能。在Hi BF的顶部，IgA1蛋白酶浓度比BF中部和底部高，因此，IgA1蛋白酶对BF的结构具有保护作用［14］。

2.7Hia蛋白是一种Hi表面的黏附素，由hia基因编码。在荚膜型Hi中，hia以同源基因hsf的形式存在。Hia有两个同源结合区HBD1、HBD2，能和人呼吸道细胞表面受体发生结合，诱导细菌的定植及微菌落形成。体外BF定量实验发现，hia阳性的菌株形成BF的能力显著增强［2］。

3　DNA

DNA是细菌的遗传物质，除了存在于细菌的细胞质外，在BF形成过程中，DNA还以胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）的形式出现在BF胞外基质中［15-16］。4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）是一种能和活体DNA特异性结合的荧光染料，在358～461 nm处发出蓝光。用DAPI标记Hi特异性抗体，孵育Hi BF后，激光共聚焦显微镜观察，在BF中，DNA呈现一种厚实的网状结构，是BF的基本骨架和主要成分，用DNaseⅠ酶处理早期的BF，发现BF的发育受到抑制，结构变得疏松而容易解离［9］。

人β防御素3（Human-defensin-3，hBD-3）是一种能同时作用于革兰阴性和革兰阳性菌的抗菌肽，在皮肤和腔道等部位分泌表达。Hi BF中的胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）能和hBD-3结合，抵抗人体固有免疫反应，维持BF的结构和BF内细菌的生存［17］。

DNA结合蛋白（DNA-binding proteins from starved cells，Dps）属于铁蛋白超家族，能结合铁离子，为细菌生长提供营养物质。Dps在不同的Hi菌株间高度保守，氨基酸排列顺序完全一致。在BF中，Dps的转录随膜内氧化压力的增加而增加。Dps缺失后，细菌对外界氧化压力敏感性提高；Dps的存在，可以保护细菌抵抗氧化作用继续生存；Dps也可以结合细菌DNA，形成一种稳定有序的Dps-DNA复合体，增强细菌BF对宿主黏膜的黏附性，抵抗宿主免疫清除作用［18］。

4　脂寡糖（lipooligosaccharide，LOS）

LOS是Hi表面的一种黏附素，其本质是一种丢失了特异性O抗原的脂多糖，结构中含有多个成分和结构不同的糖基，LOS含有类似于人糖脂类碳水化合物的决定基，可逃避来自人体天然免疫的攻击。

N-乙酰神经氨酸（N-acetyl-neuraminic，NeuAc）是一种唾液酸（sialic acid，SA），唾液酸在细胞和细胞、细胞和环境异物的黏附活动中有着重要的作用。Hi从环境获取NeuAc后，可以通过CMP-NeuAc合成酶siaβ运输作用，使NeuAc先连接到一个胞苷-单磷酸上，然后再通过胞苷-单磷酸将NeuAc连接到LOS糖链蛋白上，使LOS唾液酸化。流室法培养流Hi发现，一个CMP-NeuAc合成酶siaβ缺失、LOS不能完成唾液酸化的菌株，其形成BF的能力显著下降；同时，与亲本株相比，该菌株在大鼠中耳和肺部BF黏附时间显著缩短［19］。磷酸胆碱（phosphorylcholine，PCho）也是LOS化学修饰的一种形式，Hi基因序列存在一个偶然位点（contingency loci）lic1，共包括licA、licB、licC、licD共4个基因，licD基因调控Hi LOS磷酸胆碱化的表达［20］。PCho可以促进细菌对宿主细胞的黏附。在BF形成初期，PCho不是一个必须的条件，但在BF后期，PCho可以促进BF的成熟和稳定。PCho化与BF厚度、覆盖面积、光滑程度、生物量呈正相关［21］。

5　密度感应（quorum　sensing,QS）系统

QS系统是细菌通过信号分子感知群体密度多少，调控自身生理活动进而使细菌群体达到生存稳态平衡的一种自我调控能力。luxS基因是包括Hi在内的大多数细菌QS系统中重要的调控因子，可调控细菌的毒素因子和细菌代谢。luxS调控合成自诱导分子（Autoinducer 2，AI-2），后者可以促进鞭毛表达，增强细菌活动；AI-2也是一种菌种间信号分子，可以在不同的细菌间传递化学递质，协调种群间的生理活动［22］，luxS基因缺失后，AI-2浓度降低，细菌群体之间信号交流减弱，生存稳态失衡；同时，luxS基因缺失还影响Hi LOS的磷酸胆碱化表达，进而影响BF的形成［23］。

腺苷三磷酸结合盒（ATP-blinding-cassette，ABC）转运蛋白是一种跨膜蛋白，利用结合和水解ATP产生的能量对胞内外的生物分子进行转运［24］。RbsB是Hi ABC转运蛋白中由rbsB（the ribose transport operon）编码的一个蛋白，该蛋白能摄取细菌群体中的AI-2，并在胞内外运输，对BF内细菌密度稳定和稳态均衡具有重要意义［25］。

6　双组份信号系统（two-component　signaling　system）

该系统最早在大肠杆菌氮调节蛋白系统中发现，其功能是使微生物在不同的环境下感受外界刺激，并作出相应的反应。双组份信号系统由激酶感受器（histidine kinase，HK）和效应调节器（response regulator，RR）组成。激酶感受器感受到环境变化后，通过磷酸转移途径将信号传递给转录调节器，效应调节器进而通过上调或下调靶基因的转录来作出回应［26］。Hi含有多个不同的双组份信号系统，QseB/C是由qseB和qseC等位基因编码的一个双组份信号分子，由一个启动子控制。实验研究揭示，和亲本株相比，qseC基因缺失的Hi BF在48 h后密度明显减少，说明qseC缺失后，调节器的功能受到影响，BF内的细菌不能继续在QS的调控下稳定生长［27］。

总之，Hi是一种常见的BF菌，探讨Hi BF形成因素和机制，对认识和治疗BF病具有及其重要的指导意义。

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（2014-05-04收稿2014-09-20修回）

（本文编辑魏杰）

Role of haemophilus influenza factor in the process of biofilm formation

GAO Xue1，SHANG Xiaoling2，ZHANG Yutuo1△
1 Institute of Pathogen Biology and Immunology of Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China；2 Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery of the First Affiliated Hospital of Hebei North University
△Corresponding AuthorE-mail:yvtuozhang@sina.com

The Haemophilus influenzae（Hi）is a common opportunistic pathogen from human respiratory tract.The lower immunity can cause the disease.After the biofilm（BF）is formatted by Hi at the site of infection，the antibiotic sensitivity is declined，which often causes the chronic disease，inducing the difficulty in clinical treatment.In recent years，the pathogenicity of Hi BF and BF form related factors have gradually become the focus of clinical and basic research.This paper reviewed recent studies as following.

haemophilus influenza；biofilms；drug tolerance；review

R378.4

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.029

河北省卫生厅医学科学研究重点课题（20110537）

1张家口，河北北方学院病原生物与免疫学研究所（邮编075000）；2河北北方学院附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科

△E-mail:yvtuozhang@sina.com