花荵叶片愈伤组织的诱导1)

刘紫微 赵鑫 焦孟月 张彦妮

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

花荵叶片愈伤组织的诱导1)

刘紫微 赵鑫 焦孟月 张彦妮

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

以花荵(Polemoniumcoeruleum)叶片为外植体，研究了不同消毒方法对叶片白化率的影响、不同激素种类及激素组合对叶片愈伤组织诱导的影响。结果表明：较适合花荵叶片消毒的方法是质量分数为75%的酒精消毒30 s后、质量分数为1%的NaClO消毒6 min，叶片白化率低，存活率较高。叶片愈伤组织诱导最佳培养基：MS+1.0 mg·L-16-BA(6-苄氨基腺嘌呤)，诱导率为88.9%。

花荵；叶片愈伤组织；诱导培养基；叶片白化率

花荵(Polemoniumcoeruleum)为花荵科花荵属多年生草本植物，一般生长在海拔1 500 m以上的亚高山草甸中，分布于东北、华北等省区。株高30～80 cm，奇数羽状复叶，互生，叶轴具狭翅，具小叶11至21片，圆锥状聚伞花序顶生，花萼宽钟形，先端5裂，花冠蓝紫色，具有很高的观赏价值，抗寒性强，是有待开发和应用的野生花卉。在中国植物志第64卷中记载：花荵科有15属约300种，主产北美洲西部，欧洲、亚洲只有很少的种类；我国有3属6种，其中4种系栽培。国内外对花荵的研究多集中于其药理作用，研究实验证明，花荵科植物对一些动物的胆固醇性动脉硬化有治疗的作用，使皮肤、动脉、肝脏、角膜及其他内脏类脂质的黏着减少。花荵科植物能够使积累在细胞内的胆固醇及时排出，起到了降低血脂的作用[1]。对同属的宿根福禄考和丛生福禄考研究的很多，且在组织培养快速繁殖方面也有很多研究，已经建立了完善的组织培养再生体系[2-9]；但对花荵的繁殖栽培研究很少。鉴于花荵在园林美化及医学上的应用前景，有必要通过组织培养对其进行扩繁，为其种质资源保存和园林推广应用提供参考。本文以花荵叶片为外植体，对其进行愈伤组织诱导，以期为下一步完善花荵组织培养体系建立奠定基础。

1 材料与方法

试验材料：以东北林业大学园林学院温室里盆栽的花荵植株为母株，选用生长良好的幼嫩叶片作为外植体。

外植体的消毒：选取花荵的幼嫩叶片，用加有洗涤剂的水洗2～3 min，自来水冲洗30 min。在超净工作台上，用75%的酒精消毒30 s，倒去酒精，无菌水冲洗1次；再分别用不同质量分数(1%、2%、3%)的次氯酸钠(NaClO)消毒6 min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干表面的水分，将叶片剪成约1 cm2的块，接种到MS基本培养基上。两周后，统计污染率、白化率、存活率，筛选出适宜消毒的NaClO质量分数。

消毒时间的选择：用筛选出的最适宜质量分数的NaClO消毒6、8、10 min，消毒方法同上，之后放在培养室培养。两周后，观察并统计外植体的污染率、白化率，选出最适的消毒时间。

愈伤组织的诱导：将花荵叶片清洗消毒后，切成1 cm2左右的块，接种到不同的诱导培养基上。诱导培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(缩写6-BA)(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)；MS基本培养基+玉米素(缩写ZT)(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)；MS基本培养基+2,4-二氯苯氧乙酸(缩写2,4-D)(0.05、0.10、0.20 mg·L-1)；MS附加不同浓度6-BA、2,4-D或ZT分别与不同浓度萘乙酸(缩写NAA)混合成的培养基。20 d后，观察并统计愈伤组织诱导率及叶片的变化。每种处理接种20个叶片，3次重复。白化率=(白化的外植体数/接种外植体数)×100%；污染率=(污染的外植体数/接种外植体数)×100%；诱导率=(产生愈伤组织的外植体数/接种的外植体数)×100%。

2 结果与分析

2.1 消毒剂质量分数和消毒时间的确定

由表1可见：NaClO的质量分数对叶片白化率影响较大，随着消毒剂质量分数的增加，污染率降低，但白化率大幅度增加。质量分数为3%的NaClO处理的叶片，白化率为100%。白化率较高，主要是因为叶片脱毒时消毒剂质量分数较高或消毒时间过长，对叶片组织破坏[10]。综合考虑，NaClO质量分数为1%，最适宜消毒。

表1 不同质量分数NaClO对叶片的消毒效果

由表2可见：消毒时间延长，增加了叶片的白化率。消毒6 min时白化率最低，污染率也相对较低。综合考虑，NaClO的消毒时间，6 min为适宜。

表2 不同消毒时间对叶片的影响

2.2 愈伤组织的诱导

2.2.1 不同浓度6-BA、2,4-D、ZT对花荵叶片愈伤诱导的影响

在培养基上添加不同浓度的6-BA、2,4-D、ZT诱导叶片愈伤组织，结果表明(见表3)：激素种类不同，诱导效果不同。随着6-BA浓度的增加，愈伤组织诱导率先增加后降低，愈伤组织的颜色、紧密度、长势不同。6-BA浓度为0.5 mg·L-1时，叶片在培养17 d后，产生淡绿色愈伤组织，结构紧实，长势一般；6-BA浓度为1.0 mg·L-1时，在接种15 d时，出现淡绿色愈伤组织，结构疏松，长势良好，诱导率最高(88.9%)；当6-BA浓度为1.5 mg·L-1时，叶片在培养15 d时，出现绿色愈伤组织，结构紧实，长势一般。2,4-D浓度为0.05 mg·L-1时，叶片在培养16 d时，出现淡绿色疏松状愈伤组织，长势良好，诱导率为72.2%；当2,4-D浓度为0.10 mg·L-1时，诱导出的愈伤组织呈绿色紧实状，愈伤组织出现时间为15 d，诱导率为66.7%；当2,4-D浓度为0.20 mg·L-1时，在14 d出现绿色愈伤组织，诱导率为44.4%。随着2,4-D浓度的增加，产生的愈伤组织颜色加深，结构更紧实。由此可见，低浓度(0.05 mg·L-1)的2,4-D诱导愈伤组织效果较好，增加浓度反而抑制了愈伤组织的形成。随着ZT浓度的增加，愈伤组织颜色由淡绿色疏松状、绿色疏松状、绿色紧实状变化。愈伤组织出现的时间大致相同，均在15 d左右；愈伤组织的诱导率先增后降，在ZT为0.5 mg·L-1时，诱导率最高(77.8%)。综合考虑，1.0 mg·L-16-BA诱导花荵叶片形成愈伤组织效果最好。

表3 6-BA、2,4-D、ZT单一激素对叶片愈伤组织诱导的影响

2.2.2 不同浓度ZT和NAA对花荵叶片诱导愈伤的影响

将花荵叶片接入不同浓度ZT和NAA组合的培养基上，结果发现(见表4)：ZT浓度为0.5 mg·L-1的3种培养基中，叶片愈伤组织诱导率相对较高；NAA为0.05、0.10 mg·L-1时，诱导率均为66.7%。但愈伤组织在NAA浓度为0.10 mg·L-1时，长势较好。因此，在ZT和NAA的组合中，诱导叶片愈伤组织的最佳激素配比为：0.5 mg·L-1ZT+0.1 mg·L-1NAA。

表4 不同浓度ZT和NAA对愈伤组织的影响

2.2.3 不同浓度6-BA和NAA对花荵叶片诱导愈伤的影响

将花荵叶片接种到不同浓度的6-BA和NAA的混合培养基上，结果发现(见表5)：当6-BA浓度为1.0 mg·L-1时，随着NAA浓度的增加，诱导率呈下降的趋势。6-BA浓度为1.0 mg·L-1、NAA浓度为0.01 mg·L-1时，诱导率最高(83.3%)，且愈伤组织为淡绿色，结构疏松，长势好。所以，诱导叶片愈伤组织的最佳6-BA和NAA的组合为：1.0 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA。

表5 不同浓度6-BA和NAA对愈伤组织的影响

2.2.4 不同浓度2,4-D和NAA对花荵叶片诱导愈伤的影响

将叶片接种到加有不同浓度2,4-D和NAA培养基上，结果发现(见表6)：在加有2,4-D的培养基上，叶片均产生愈伤组织。在2,4-D为0.05 mg·L-1、NAA为0.01 mg·L-1和0.05 mg·L-1时，诱导率最高(均为66.7%)，愈伤组织颜色为淡绿色，长势良好。随着NAA浓度的增加，愈伤组织颜色变深，且结构变得更紧实。而2,4-D浓度为0.2 mg·L-1时，愈伤组织诱导率相对较低，对于花荵叶片，0.2 mg·L-1属于高浓度，高浓度的2,4-D会抑制愈伤组织的形成。

表6 不同浓度2,4-D和NAA对愈伤组织的影响

3 结论与讨论

外植体的选择，对于植物的组织培养十分重要。不同年龄、不同基因型、不同部位的外植体，对培养的反应和繁殖效果有差异[11]。因花荵分枝少、叶片多，对植物观赏性影响不大，所以本实验选用花荵叶片作为外植体进行愈伤组织诱导。在组织培养中，常用的消毒剂有升汞(HgCl2)、NaClO、高锰酸钾(KMnO4)等，由于NaClO容易清洗、对环境没有污染，实验选择NaClO作为消毒剂。消毒剂质量分数的大小、消毒时间的长短，对外植体的消毒起着重要影响，而两者之间的影响又存在着线性关系。使用3% NaClO时，白化率达到100%。消毒时间过长，会造成白化率升高(消毒10 min，白化率为32.1%)；随着消毒时间的减少，在白化率和污染率较低时，选为适宜的消毒时间。本实验得到的适宜消毒方法：用装有75%酒精的无菌三角瓶中迅速冲洗30 s后，再用1%的NaClO消毒6 min，再用无菌水冲洗3次，污染率为3.1%、白化率为9.3%。

植物激素种类和浓度，对外植体愈伤组织诱导影响较大。本实验分别用不同浓度的ZT、6-BA、2,4-D以及它们分别与不同浓度NAA混合进行试验，其中：6-BA的诱导效果最好，当加入NAA后三种激素的诱导效果都有所下降，但相对而言，低浓度(0.01 mg·L-1)有利于愈伤组织的诱导。这一结果与宋利伟等[12]的研究结果不同。多数研究认为，2,4-D是影响愈伤组织质量及愈伤组织分化能力的重要因子，在一定的浓度范围内，随着2,4-D浓度的增加诱导率增高[13]。但对花荵叶片，低浓度(0.05 mg·L-1)的诱导效果好，且在本实验中其诱导效果不如6-BA和ZT。再次说明，基因型不同，激素的诱导效果不同。每种植物都要进行激素种类和浓度的探究。对于目前得到的愈伤组织进一步分化，还有待进一步试验研究。

[1] 秦瑀.花荵水煎液对实验性高脂血症动物作用的研究[J].吉林农业大学学报，2005，27(3)：296-298，305.

[2] 殷丽青，黄卫昌，胡永红，等.宿根福禄考组织培养快速繁殖技术[J].上海交通大学学报：农业科学版，2008，26(2)：161-164.

[3] 高丽霞，孔旭晖.锥花福禄考的组织培养及快速繁殖[J].中国农学通报，2005，21(12)：314-315.

[4] 郭旭欣.宿根福禄考组织培养及快繁技术[J].北方园艺，2009(3)：117-118.

[5] 弭晓菊，李玉芬.宿根福禄考组织培养技术与快繁研究[J].哈尔滨师范大学自然科学学报，1997，13(3)：85-88.

[6] 文言，李玥莹.锥花福禄考组织培养的研究[J].沈阳农业大学学报，1999，30(2)：125-127.

[7] 建德锋，于延申，辛丽红.丛生福禄考的组织培养试验[J].吉林蔬菜，2004(1)：33.

[8] 周强.多效唑对宿根福禄考的矮化效应研究[D].长春：吉林农业大学，2013.

[9] 张伟.两种福禄考组织培养再生及受体再生体系建立[D].哈尔滨：东北林业大学，2008.

[10] 任敏，吴羽晨，张家洋，等.金银花愈伤组织的诱导[J].江苏农业科学，2015，43(3)：38-40.

[11] 于传.美国红枫(Acerrubrum)的组织培养技术体系研究[D].重庆：西南大学，2013.

[12] 宋利伟，张存旭，康永翔，等.太白米离体愈伤组织诱导及植株再生[J].东北林业大学学报，2014，42(9)：107-110，115.

[13] 陈季琴，韩烈保.正交设计在多年生黑麦草组织培养中的应用[J].中国草地，2004，26(6)：57-62，72.

Callus Induction from Leaves ofPolemoniumcoeruleum//

Liu Ziwei, Zhao Xin, Jiao Mengyue, Zhang Yanni

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2015,43(9)：45-47.

We used the leaves ofPolemoniumcoeruleumto study the effects of different disinfection method, different hormone type and hormone combination on callus induction from leaves. The best disinfection method was with 75% ethanol for 30 s and 0.1% NaClO for 6 min, the leaf bleaching rate was low, and the survival rate was high. Optimal callus induction medium was MS medium with 1.0 mg·L-16-BA with the induction rate of 88.9%.

Polemoniumcoeruleum; Callus induction from leaf; Induction medium; Leaf bleaching rate

1)黑龙江省留学归国基金项目(LC201410)。

刘紫薇，女，1992年2月生，东北林业大学园林学院，学士本科生。E-mail：1696275141@qq.com。

张彦妮，东北林业大学园林学院，副教授。E-mail：ynzhang808@126.com。

2015年6月30日。

Q943.1

责任编辑：张 玉。