水杨酸对毛枝五针松幼苗生长发育和防御酶活性的影响1)

向振勇 康洪梅 张珊珊 杨文忠

(珍稀濒特森林植物保护和繁育国家林业局重点实验室(云南省林业科学院)，昆明，650201)

水杨酸对毛枝五针松幼苗生长发育和防御酶活性的影响1)

向振勇 康洪梅 张珊珊 杨文忠

(珍稀濒特森林植物保护和繁育国家林业局重点实验室(云南省林业科学院)，昆明，650201)

为了克服毛枝五针松幼苗发育不良、根系细弱不发达、死亡率高等问题，采用营养袋育苗试验，用不同质量浓度的水杨酸(SA)溶液(0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 g·L-1)喷洒毛枝五针松幼苗，研究不同质量浓度的SA溶液对毛枝五针松幼苗生长发育和针叶防御酶活性的影响。结果表明：SA增强了毛枝五针松体内的PAL(苯丙氨酸解氨酶)、PPO(多酚氧化酶)、POD(过氧化物酶)酶活性，激发毛枝五针松对病虫害的防御能力，促进了毛枝五针松幼苗的生长发育，且以SA质量浓度为0.50～1.00 g·L-1时，毛枝五针松幼苗的各形态指标和防御酶活性与CK差异显著(P<0.05)。

毛枝五针松；水杨酸；幼苗；生长发育；防御酶

毛枝五针松(Pinuswangii),属松科松属(pinus)白松亚属(Subgenus),是国家Ⅱ级保护植物，云南特有种。按IUCN地方濒危等级标准评价属于“极危种CR”。毛枝五针松分布极狭窄，仅零星分布于云南省文山州的麻栗坡、西畴、马关等3个县的极少石灰岩地区。由于森林破坏严重，目前仅存358株，分布于悬崖峭壁处[1]。毛枝五针松植株干形通直，树形优美，姿态高雅，生长缓慢，是较好的盆景材料；且木材芳香耐久，材质致密坚韧，是当地较受欢迎的寿木，受到偷砍盗伐的严重威胁。由于其本身是极濒危的保护植物，且在当地又具有一定的市场价值，于是人工方式繁育出质优量大的毛枝五针松苗木就较为迫切。采用常规栽培措施对毛枝五针松进行繁育后,幼苗植株瘦弱，抗逆性差，幼苗移栽后生长缓慢，会从嫩稍到整株枯萎死亡，且死亡率高。因此，提高毛枝五针松自身的防御能力，改善幼苗质量成为其繁育成功的关键瓶颈之一。目前，已经有很多研究发现,应用生长调节剂(水杨酸)可以调节和改善植物生长发育状况,提高植物抗逆性等[2-4]。

水杨酸(SA)是一种植物内源信号物质和植物激素，是植物体内产生的小分子酚类化合物，化学名称为邻羟基苯甲酸,是肉桂酸的衍生物,广泛存在于高等植物中。大量研究表明，SA是植物抗病反应的信号分子，能够激活植物过敏反应和系统获得性抗性[4-7]。有研究表明，外源SA可诱导番茄、拟南介、花生、重瓣玫瑰等多种植物病程相关防御酶表达(如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD))[8-11]，从而启动植株自身的防御机制，提高植物对病原微生物的抗性。本文研究了SA对毛枝五针松生长发育和防御酶活性的影响，以期能够为提高其幼苗质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料培养与处理

选取苗圃地内2 a生长状况一致的幼苗，进行随机分组，每组设置9个重复，测量所有植株高度。采用不同质量浓度的SA于16:00—17:00进行整株喷洒处理，每隔5 d处理1次，共处理6次，其处理的质量浓度分别为0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 g·L-1。最后1次处理的第2 d 10:00前测量所有植株形态指标，同时，剪取相同部位的针叶放入封口袋中，迅速放入冰盒后带回实验室，备样放于冰箱中-20 ℃冷冻保存，用于酶活性测定。

1.2 形态指标的测定项目与方法

用游标卡尺对9个重复的幼苗植株高度进行测量；取3株,用自来水冲洗根系,测定根长,用量筒测定根系体积，然后用纱布吸干水分,采用TTC法[10]测定根系活力。

1.3 防御酶提取和活性测定

将从冰盒中的样品取出，分别称取样品0.1 g，置于各1 mL PAL、PPO、POD粗酶提取缓冲液中，冰浴研磨匀浆，在0～4 ℃下12 000 r·min-1离心15 min，上清液即为粗酶液，放置于冰箱中-20 ℃保存备用。PAL、PPO、POD活性测定参照[12]～[14]方法进行。

1.4 数据处理方法

试验数据采用Excel 2007和SPSS16.0软件进行数据分析，处理之间的显著性差异采用单因素方差分析，平均值的多重比较采用最小显著极差法。

2 结果与分析

2.1 SA对毛枝五针松幼苗生长发育的影响

不同质量浓度的SA处理对毛枝五针松幼苗相对生长量、根长、根体积及根系活力的影响结果见表1。

表1 水杨酸对毛枝五针松幼苗生长和根系发育的影响

由表1可知，不同质量浓度的SA溶液对毛枝五针松生长发育均有促进作用，其中相对生长量以SA的质量浓度为0.50 g·L-1的处理，促进作用最大，比对照增加了128.42%。而根长、根体积、根系活力则是SA的质量浓度为1.00 g·L-1处理效果最好，分别比对照增加了48.57%、194.48%和457.60%。对SA处理的结果用最小极差法进行显著性差异分析，结果发现当处理质量浓度为0.05和1.00 g·L-1时，处理结果差异不显著。以上数据说明：SA处理可显著改善毛枝五针松幼苗的生长状况，对其生长发育具有积极的促进作用；且以SA处理质量浓度为0.50～1.00 g·L-1时，对毛枝五针松幼苗的生长发育促进作用最好。

2.2 SA对毛枝五针松防御酶活性的影响

不同质量浓度的SA处理对毛枝五针松幼苗的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)的影响结果如表2。由表2可知，不同质量浓度的SA溶液对毛枝五针松防御酶活性均有促进作用，且随着处理质量浓度的上升，防御酶活性先升高后降低；当处理质量浓度为1.00 g·L-1时，防御酶活性达到最高，其中PAL活性比CK高58.42%，PPO活性比CK高37.73%，POD活性比CK高167.55%。对SA处理的防御酶活性结果用最小极差法进行显著性差异分析(P<0.05)，结果发现当处理质量浓度为0.50和1.00 g·L-1时，3种防御酶的活性值较高，处理间差异不显著，且均与对照CK形成显著差异，说明此质量浓度范围下PAL、PPO、POD酶活性较强。

表2 水杨酸对毛枝五针松幼苗防御酶活性的影响

3 讨论与结论

SA作为一种外源信号分子，主要是通过植物细胞膜脂过氧化的诱导产生过敏反应(HR)，并诱导系统获得抗病性的标记基因(PR基因)表达，从而诱导植物的抗病性[5]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物中催化苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶，随着PAL活性升高植物体内木质素、木质栓、黄酮类色素和异黄酮类植保素等众多次生物质的质量分数也随之升高，进而提高自身抗病能力，其酶活性的增加与抗病性成正比[15-17]。多酚氧化酶(PPO)是在植物体内广泛存在的一种抗营养酶类，能够催化多酚化合物次生代谢，降低植物的营养价值，阻止昆虫的取食，与植物的抗病虫能力有着密切的关系[18-20]。过氧化物酶(POD)是植物保护酶系的重要保护酶之一，POD酶活性与枯萎病密切相关，能够提高植物的抗性，降低质膜的受伤害程度[21-23]。本试验表明，不同质量浓度SA处理后，毛枝五针松幼苗体内防御酶PAL、PPO、POD的活性明显比对照增强，说明外源SA能够增强毛枝五针松抵御病菌侵害和昆虫取食的能力。当SA处理质量浓度为1.00g·L-1时，PAL、PPO和POD的酶活性最强，与0.50g·L-1SA处理后的3种酶活性差异不显著，而与CK及其它处理间的酶活性差异显著(P<0.05)。说明外源SA质量浓度为0.50～1.00g·L-1时，SA对诱导毛枝五针松防御酶活性的影响最为显著。

植物吸收、转化和储藏营养物质要依靠根系来完成，根系生长的好坏会直接影响植物地上部分生长发育状况和水土保持能力。与植物根系发育相关的两个关键酶是PPO与POD，其中，PPO酶具有辅助生根的作用，可以促进植物不定根的形成[19-20]，POD参与多种生理生化过程，对植物的生长发育、器官形态形成都起到重要作用，是植物生根的标志之一[21-23]。本试验显示不同质量浓度的SA处理可显著提高毛枝五针松幼苗中POD与PPO酶活性，且相对应的处理质量浓度下，毛枝五针松幼苗的根长、根系体积和根系活力均比CK要高，说明外源SA通过增强毛枝五针松体内的PPO与POD酶活性从而促进了毛枝五针松根系的生长发育。

[1] 周云,蒋宏,杨文忠,等.极小种群植物毛枝五针松的野生资源状况研究[J].西部林业科学,2012,41(3):80-83.

[2] 熊光元,郭娇.水杨酸对金鱼草种子萌发和幼苗生长的影响[J].种子,2014,33(4):79-81.

[3] 回振龙,王蒂,李宗国,等.外源水杨酸对连作马铃薯生长发育及抗性生理的影响[J].干旱地区农业研究,2014,32(4):1-8.

[4] 江厚龙,李鹏,李钠钾,等.外源诱抗剂对烟草青枯病的诱抗效果研究[J].中国农学通报,2014,30(28):286-290.

[5] 尹玲莉,侯晓杰.植物抗性信号分子：水杨酸研究进展[J].中国农学通报,2007,23(1):338-342.

[6]WuY,ZhangD,ChuJY,etal.TheArabidopsisNPR1proteinisareceptorfortheplantdefensehormonesalicylicacid[J].CellReports,2012,1(6):639-647.

[7]Rivas-SanVicenteM,PlasenciaJ.Salicylicacidbeyonddefence:itsroleinplantgrowthanddevelopment[J].JournalofExperimentalBotany,2011,62(10):3321-3338.

[8] 鄢洪海,赵志强,王琰,等.水杨酸处理对花生主要防御酶活性的影响[J].花生学报,2006,35(4):20-22.

[9] 李丽,刘峥,杨秀芬,等.植物激活蛋白对番茄防御酶活性的影响[J].湖南农业大学学报,2008,34(5):534-537.

[10] 王媛,杨红玉,程在全.SA诱导拟南芥对灰霉病的抗性与木质素含量的关系[J].植物保护,2007,33(4):50-54.

[11] 严俊鑫,迟德富,张永强,等.水杨酸诱导重瓣玫瑰对白粉病的抗性[J].东北林业大学学报,2013,41(8):95-101.

[12] 白宝璋,史国安,赵景阳,等.植物生理学(下):实验教程[M].北京:中国农业科技出版社,2001:73.

[13] 中国科学院上海植物生理研究所,上海市植物生理学会.现代植物生理学实验指南[M].2版.北京:科学出版社,2004:317-318.

[14] 张志良,瞿伟箐.植物生理学实验指导[M].3版.北京:高等教育出版社,2003:123-124.

[15] 孙利,万勇善,刘风珍,等.花生不同品种叶片类黄酮含量和相关合成酶活性对PEG胁迫的响应[J].中国油料作物学报,2014,36(2):198-205.

[16] 雒军,王引权,温随超,等.当归苯丙氨酸解氨酶基因片段克隆和组织特异性表达分析[J].草业学报,2014,23(4):130-137.

[17]KimDS,HwangBK.Animportantroleofthepepperphenylalanineammonia-lyasegene(PAL1)insalicylicacid-dependentsignallingofthedefenceresponsetomicrobialpathogens[J].JournalofExperimentalBotany,2014.doi:10.1093/jxb/eru109.

[18] 王伟,徐建民,李光友,等.24个桉树品系遭受桉树枝瘿姬小蜂危害后防御酶活性变化[J].中南林业科技大学学报,2012,32(6):24-28.

[19] 马晓乾,滑莎,宋小双,等.模拟昆虫取食对红皮云杉幼苗根部酶活性的影响：根部中保护性酶和防御酶活性的变化情况[J].中南林业科技大学学报,2012,32(9):37-40.

[20]SahbazR,LiebereiR,AniszewskiT.Polyphenoloxidase(PPO,catecholase)activityduringgerminationandearlyseedlinggrowthofCicermilkvetch(Astragalus cicerL.)[J].JournalofAppliedBotanyandFoodQuality,2012,82(2):163-169.

[21] 朱利君,胡进耀,罗明华,等.水杨酸对珍稀濒危植物珙桐的影响[J].江苏农业科学,2014,42(6):213-215.

[22] 王卓,徐碧玉,贾彩红,等.香蕉过氧化物酶基因表达和酶活性与香蕉抗枯萎病的广西[J].中国农学通报,2014,29(34):115-121.

[23]LiCJ,YanCX,ZhangTT,etal.Phytotoxicityofcadmiumonperoxidation,superoxidedismutase,catalaseandperoxidaseactivitiesingrowingpeanut(Arachis hypogaeaL.)[J].AfricanJournalofBiotechnology,2015,14(13):1151-1157.

Effects of Salicylic Acid on the Growth and Defensive Enzyme Activity ofPinuswangiiSeedlings//

Xiang Zhenyong, Kang Hongmei, Zhang Shanshan, Yang Wenzhong

(Key Laboratory of Rare and Endangered Forest Plants of State Forestry Administration, Yunnan Academy of Forestry, Kunming 650201, P. R China)//Journal of Northeast Forestry University，2015,43(9)：115-116，124.

We used the nutrition bag nursery trials to study the effects of salicylic acid (SA) onPinuswangiiseedling growth and development, as well as defensive enzyme activities. Six different concentrations of salicylic acid (SA) solutions (0, 0.25, 0.50, 1.00, 1.50, and 2.00 g·L-1) were sprayed onP.wangiiseedlings. The SA enhanced PAL, PPO, POD enzyme activities ofP.wangiiseedlings, stimulated defense capabilities against diseases and pests, and promoted the growth and development ofP.wangiiseedlings.P.wangiiseedlings showed significantly differences in the morphological indicators and activities of defensive enzymes in 0.5-1 g·L-1compared with that of control.

Pinuswangii; Salicylic acid; Seedling, Growth and development; Defensive enzyme

1)国家自然科学基金项目(31460119)；国家林业局珍惜濒危物种野外救护与繁育项目(2013YB1002、2014YB1004、 2015YB1021)；云南省极小种群物种拯救保护项目(2013YB1005)；云南省自然科学基金项目(2013FD075)。

向振勇，男，1980年12月生，珍稀濒特森林植物保护和繁育国家林业局重点实验室(云南省林业科学院)，助理研究员。E-mail：36277546@qq.com。

杨文忠，珍稀濒特森林植物保护和繁育国家林业局重点实验室(云南省林业科学院)，副研究员。E-mail：wzyang2004@126.com。

2015年5月4日。

S723.1+39

责任编辑：王广建。