传统中药补肾固筋方对膝骨性关节炎IL-1、TNF-α的作用机制

张冲，王恒树，阚秀莲，李健，郭梅，祁永玲，韩艳丽，杨瑞成

(河北省中医院骨三科，河北医科大学第二医院，石家庄050011)

膝骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)以关节软骨变性和软骨下骨象牙样硬化为病理特征的退行性疾病。《内经·素问·痹论》:“风寒湿三气杂至合而为痹也［1］”。临床多用非甾体类药物或胫骨高位截骨术、人工关节置换术，患者难以接受［2］。中药多取补肾壮骨、活血止痛之效，如熟地、枸杞、杜仲、川牛膝等对KOA 疗效确切，延缓骨关节炎的发展、促进关节软骨修复［3］。本研究拟通过检测IL-1、TNF-α 的表达阐明补肾固筋方与骨关节炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

76 只SPF 级新西兰兔，雄性，3月龄，体重大于或等于1.5 kg，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司［SCXK(沪)2013-0011］，实验、取材及标本测定在河北医科大学实验动物中心进行［SYXK(冀)2013-1-004］。

1.2 主要试剂及仪器

兔IL-1、TNF-αELISA 试剂盒(IL-1 ELISA kit，tumor necrosis factor-α，TNF-α ELISA kit，规格:96T，Abcam US，型号:AB2202);酶联免疫检测仪(型号:ELX800 BioTek，US．);Retsch 干燥箱(型号:TG10，产地:德国Hahn，Dusseldorf，Germany，Retsch Company);恒温水箱(DDIL-5 型，上海安亭科学仪器厂);石蜡切片机(U-641 型，美国贝克曼公司);荧光显微镜系统(Leica AF6000，Germany);全自动图像分析系统(Tanon1600，中国上海);723 分光光度计(ELX8086 型，美国宝特公司);数码X 光机(GEx86型，美国GE 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备

76 只新西兰随机分成4 组(正常组、模型组、西药组及中药组)，每组19 只。造模过程2 ～3 周内各组均死亡1 只后每组各18 只。严格无菌、微创操作术后抗炎处理。

除正常组外均采用Hulth 法造模［4］。术前一晚禁食，配制成3%戊巴比妥钠按20mg/kg 兔耳缘静脉麻醉，先注射总量的2/3 随后根据情况追加10%直至麻醉成功。常规消毒趋血。右后肢膝关节内侧纵切口长约2.5 ～3 cm，明确关节腔无原发病变后，切断内侧副韧带(medial collateral ligament，MCL);完全切断前十字韧带(anterior cruciate ligament，ACL );完整切除内侧半月板但保留后十字韧带(posterior cruciate ligament，PCL)三个手术步骤造成力线内移及膝关节不稳。胫股关节面由正常外翻10°变为内翻，X 线片后肢力线内移、跛行明显;膝关节内侧应力集中继发骨小梁改变;膝关节不稳及长期被迫运动造成软骨损伤及退变。术侧肢体不固定，头孢曲松钠注射液每次0.5 ×2 g/d，肌注，连续7 d。术后第7 天即强迫兔奔跑(0.5 h/d)，活动范围约每日2h/800m 左右。造模2 周软骨改变，6 周进入平台期，10 周出现典型的晚期OA 改变，13 周可获得典型的KOA 模型。兔跛行严重每日行走≤300m、X 线片显示胫股关节内翻10°，前抽屉实验和内侧应力实验阳性即表示造模成功。造模成功率为81.3%。

1.3.2 干预方法

补肾固筋方(熟地18 g、杜仲20 g、桑寄生20 g、巴戟天15 g、川牛膝16 g、鸡血藤15 g、丹参12 g、木瓜12 g)加减，根据饮食情况，精神状态，活动自如，喜暖恶寒，被毛光滑有光泽，四肢各关节无红肿，活动自如等情况中医辨证加减，风寒湿痹加防风、黄芪、羌活;风湿热痹加秦艽、羌活;瘀血闭阻证加桃仁、红花;肝肾亏虚偏阴虚者加枸杞子、山茱萸;偏阳虚者加菟丝子、肉桂;每剂取汁400 mL。浓缩后加蒸馏水配制成6 ～8g/10 mL;美洛昔康每粒7.5 mg，四川宝光药业股份有限公司，国药准字:H20010209批次号:120502770265;戊巴比妥钠(pentobarbital sodium，美国Sigma，货号:P3809 )。

造模3 周后开始干预，按照人及动物之间药物剂量换算:Meeh-Rubner 氏公式A = K × (W2/3 ÷10 000)，美洛昔康每日8 mg/kg，每日补肾固筋方53 g/kg，正常组、模型组生理盐水15mL 灌胃，2 次/日;连续干预8 周一疗程。

1.3.3 观察指标

(1)步态观察:Coderre T．步态分级［5］评价。0级:正常行走，行走时间＞5 min;I 级:轻微跛行，行走时间3 ～5 min;II 级:中度跛行，行走时间＜3 min。

(2)X 线检查:处死动物前拍摄兔膝关节正位DR 片，观察膝关节X 线表现。X 线损伤情况按改良的David T［6］法分级，0 度:关节面光滑无骨赘;I度:关节外侧间隙轻度狭窄;II 度:关节面粗糙明显变形伴可疑骨赘;III 度:关节间隙明显狭窄，骨赘清晰可见。

(3)形态学观察:1 mL 生理盐水灌洗关节腔，取胫骨内侧软骨面，肉眼观察兔膝关节软骨面情况，切取膝关节前方、内侧滑膜组织和股骨内髁及内髁前方两侧关节软骨及软骨下骨，剪成约0.6 cm × 0.6 cm × 0.6 cm 大小均匀组织小块，病理切片、组织染色处理，观察关节软骨的层次组成、软骨细胞变化移行及软骨下骨的情况。

(4)IL-1、TNF-α 检测:实验结束造模后药物干预8 周空腹处死动物后，立即心脏取血5 mL，3000 r/min 离心10 min 分离出血清及关节滑液－60℃冰冻保存;5000 r/min 分离出关节软骨及滑液后，－80℃超低温冰箱保存24h 后再放入液氮(－196℃)保存。ELISA 法(enzyme-linked immunosorbent assay)检测。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 肉眼及镜下观察

正常组膝关节内外侧间隙光滑平整，软骨色泽蓝白色透明，关节液量适中;模型组膝关节内侧间隙变窄，滑膜肿胀，软骨面不光滑与滑膜纤维性粘连凹凸不平，软骨剥脱;镜下见软骨细胞大小不均深层排列，软化灶形成;两个给药组关节软骨大体观察呈淡蓝半透明白色，表面平整光滑，滑膜乳白色淡黄黏稠的关节液含量较正常组稍多，镜下西药组软骨细胞排列欠完整，簇状增生;中药组关节面光滑平整软骨细胞排列完整(图1)。

2.2 IL-1、TNF-α 含量比较

模型组含量升高(P ＜0.01)。两个给药组与模型组比较含量降低(P ＜0.01)，两给药组之间比较差异无显著性(P ＞0.05)(表1)。

图1 各组软骨细胞镜下观察(HE ×40，20μm/cm)Fig．1 Histological appearance of the cartilage of rabbits in different groups．HE staining．×40

表1 各组血清及关节液IL-1、TNF-α 含量比较(±s，n =18 )Tab．1 Comparison of interleukin-1，tumor necrosis factor-α in the rabbit serum and synovial fluid

表1 各组血清及关节液IL-1、TNF-α 含量比较(±s，n =18 )Tab．1 Comparison of interleukin-1，tumor necrosis factor-α in the rabbit serum and synovial fluid

注:与模型组比较，* P ＜0.01。Note．Compared with the model group，* P ＜0.01．

分 组Groups血清Serum 关节液Synovial fluid IL-1 ng/L TNF-α pg/L IL-1 ng/L TNF-α pg/L正常组Normal 512.8±38.61* 192±18.23* 49±0.64＊＊ 33.2±0.84*模型组Model 866±44.23* 436±24.17* 92.8±0.64* 91.4±0.66*中药组Chinese medicine 644.2±36.24* 43.9±21.01* 61.4±0.85* 54.2±0.87*西药组Meloxicam 650.1±35.3* 203±16.85* 57.2±0.69* 45.4±0.58*

3 讨论

Perlman［7］报道在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)中有IL-1 的存在。IL-1 通过激活血管内皮细胞，增强内皮细胞粘附分子的分泌，促进血液中白细胞与粘附分子结合聚集在关节腔［8，9］，刺激骨小梁重塑及成骨细胞聚集增生，软骨下骨萎缩。骨质异常增生或囊性变形成骨赘，生物力学的作用使之再苏醒最终形成关节变形功能缺失［10，11］。炎性介质促进细胞浸润增加炎症反应及组织损伤，特别是IL-1 正向促使PGE2及TNF-α 在细胞质中的释放，这种表达强度及严重程度呈现递增改变［12］;研究证实TNF-α 通过促使关节软骨面滑膜中的成纤维细胞增殖纤维素样变性及多形核细胞分泌破坏骨关节面软骨和软骨下骨，同时IL-1、TNF-α 协同作用裂解蛋白多糖、降解胶原片段活性，加快软骨基质剥脱骨质暴露［13，14］。

治则温经活血、补益肝肾。君药熟地、杜仲、桑寄生，熟地微温味甘，滋阴养血、益肾填精;杜仲甘温，用于肾虚腰痛，筋骨无力;桑寄生苦甘平治风湿痹痛，腰膝酸软，筋骨无力，《本草再新》:寄生补气温中，治阴虚、壮阳道、利骨节。君药配伍促进血液循环改善关节腔内微循环，降低骨内压减轻疼痛;《纲目拾遗》:丹参性凉，味甘，通经络，和血脉［15］。臣药巴戟天、川牛膝和丹参配和君药使用可减缓关节软骨细胞的坏死、增强超氧化物歧化酶的活性反应，加速软骨细胞合成及滑液吸收［16］，阻断了骨关节炎发病过程中氧自由基的释放及恶性循环减缓软骨退变的目的［17］;佐使药鸡血藤行气活血，通络、善治手足麻木、肢体瘫痪，风湿痹痛及促进静脉系统血液返流加速代谢的作用［18］。补肾固筋方通过抑制IL-1、TNF-α 的分泌来改善滑膜液性反应，可以有效修复软骨皲裂控制软骨退变、缓解软骨细胞降解及增强滑膜渗透作用，促进软骨修复。

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