沉默信息调节因子2相关酶1在直肠癌中的表达及临床意义

齐晓莹，蒋中秀，刘洋，李宁，张晓晔

（中国医科大学附属盛京医院第四肿瘤科，沈阳 110022）

·论著·

沉默信息调节因子2相关酶1在直肠癌中的表达及临床意义

齐晓莹，蒋中秀，刘洋，李宁，张晓晔

（中国医科大学附属盛京医院第四肿瘤科，沈阳 110022）

目的探讨沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）在直肠癌中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化法检测86例直肠癌组织和30例癌旁正常直肠组织中SIRT1的表达情况，并与临床病理资料进行相关性分析。结果直肠癌组织中SIRT1的阳性表达率为88.4%，癌旁正常组织阳性率为16.6%，显著高于癌旁正常直肠组织（P＜0.001）；直肠癌组织中SIRT1的表达与TNM分期（P＜0.05）、淋巴结转移的有无（P＜0.05）、肿瘤浸润深度（P＜0.05）呈正相关；与肿瘤组织分化程度（P＜0.05）呈负相关；而与性别、年龄、肿瘤直径无关（P＞0.05）。结论SIRT1在直肠癌中表达明显高于癌旁正常直肠组织，且与TNM分期、淋巴结转移、浸润深度及肿瘤分化程度密切相关。提示SIRT1在直肠癌发生发展过程中可能具有重要作用，可以作为直肠癌判断预后的重要指标之一。

沉默信息调节因子2相关酶1；直肠癌；免疫组化

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，近30年来大肠癌在我国的发病率及死亡率明显上升，我国大肠癌中以直肠癌多见，占大肠癌的60%～75%，严重危害人们的身体健康。大肠癌的发生发展与细胞凋亡密切相关，而细胞的凋亡受到多基因的调控。SIRT1是一种依赖烟碱胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶［1，2］。通过对组蛋白及非组蛋白的乙酰化来参与调控细胞的分化、增殖以及凋亡。近年来，越来越多的研究结果显示，SIRT1在许多人类恶性肿瘤中表达上调，如前列腺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等，提示其可能在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用。本研究应用免疫组化技术对86例直肠癌组织中的SIRT1进行检测，探讨直肠癌中SIRT1表达水平与相关临床病理资料相关性及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2012年01月至2013年12月于中国医科大学附属盛京医院手术切除直肠癌石蜡标本共86例，临床资料完整，男性46例（53.5%），女性40例（46.5%），年龄32～79岁，平均年龄（60.1±7.5）岁。高分化4例（4.7%）、中分化78例（90.6%）、低分化4例（4.7%）；无淋巴结转移56例（65.1%）、有淋巴结转移30例（34.9%）；TNM分期按照AJCC/UICC TNM临床分期标准：I期24例（27.9%）、Ⅱ期24例（27.9%）、Ⅲ期38例（44.2%）。所有病例术前均未行化疗、放疗或其他治疗，所有切除标本均经病理确诊。另设30例癌旁正常直肠组织（均经病理证实）作为对照组。所有标本均经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，标本连续切片，切片厚度为4 μm。

1.2 主要试剂

SIRT1抗体购自美国Abcam公司，二抗试剂盒、DAB试剂盒、二抗稀释液等购自北京中杉金桥公司。

1.3 方法

免疫组化染色：采用SP法免疫组化染色：石蜡切片常规脱蜡水化，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶活性1 h，PBS漂洗5 min×3次，热修复抗原15 min，缓慢冷却至室温，PBS漂洗5 min×3次，非免疫血清封闭2 h，一抗（小鼠抗人单克隆抗体1∶400）孵育4℃过夜，PBS漂洗5 min×3次，相应二抗孵育室温1 h，PBS漂洗5 min×3次，SP试剂每张切片1滴室温下作用1 h，DAB显色80 s，自来水终止显色5 min，蒸馏水漂洗5 min，苏木素核复染6 min，自来水冲洗10 min，蒸馏水漂洗5 min，切片脱水、透明，树胶封片。用PBS代替一抗作阴性对照。

免疫组化结果判定：SIRT1表达主要为细胞质及细胞核出现棕黄色颗粒。由2位经验丰富的病理医师进行双盲阅片，采用半定量结果判断，分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分。参照Andre［12］评分标准，随机选取5个高倍视野（×400）计数肿瘤细胞总数和阳性细胞数，得出阳性细胞百分率，根据免疫组化染色阳性肿瘤细胞的比例和染色强度进行评分：无阳性细胞为0分，＜10%为1分，10%～50%为2分，＞50%为3分；无着色为0分，轻度着色（浅黄色）为1分，中度着色（棕黄色）为2分，重度着色（棕褐色）为3分。将上述2项得分相加：＜3分为阴性（-），≥3分为阳性（+）。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行数据处理分析，计数资料采用χ2检验，采用Spearman等级相关分析法进行相关性分析，结果以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SIRT-1在癌旁正常直肠组织和直肠癌组织中的表达

SIRT-1阳性染色为癌细胞核和/或胞质中出现棕黄色颗粒。免疫组化结果表明，直肠组织中SIRT -1的阳性表达率明显高于癌旁正常直肠组织（χ2= 54.279，P＜0.001），见图1，分别为88.4%（76/86）、16.6%（5/30），差异有统计学意义，见表1。

图1 SIRT1在正常直肠黏膜及直肠癌组织中的表达 SP×200Fig.1 The expression of SIRT1 in normal rectal mucosa and rectal cancer tissue SP×200

2.2 直肠癌组织中SIRT1的表达水平与其各种临床病理特征的相关性

在直肠癌组织中，SIRT1表达水平高低与年龄、性别、肿瘤直径无关（P＞0.05）；TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的患者中SIRT1阳性表达率分别为70.8%、91.7%、97.4%（χ2=10.431，P＜0.05）。有、无淋巴结转移的患者中SIRT1的表达率为100%和82.1%（χ2= 6.062，P＜0.05）；肿瘤未侵润肌层、浸润肌层阳性表达率为71.4%和96.6%（χ2=11.599，P＜0.05）；高、中、低分化的阳性表达率为50.0%、92.4%、50.0%。本实验的结果表明直肠癌组织中SIRT1的表达与肿瘤的TNM分期（r=0.324，P＜0.05）、浸润深度（r= 0.367，P＜0.05）、有无淋巴结转移（r=0.265，P＜0.05）呈正相关，而与组织的分化程度（r=-0.358，P＜0.05）呈负相关。

表1 直肠癌与正常直肠黏膜组织中SIRT-1的表达Tab.1 The expression levels of SIRT-1 in different rectum tissuse

表2 直肠癌中SIRT1的表达水平与其临床病理特征间的关系Tab.2 Relationship between the expression of SIRT1 in colorectal cancer tissue and clinicopathological features

3 讨论

SIR2相关酶类（Sir2-related enzymes，sirtuins）是1995年Sinclair等［1］于酵母中发现的，是一类依赖NAD+的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶。在哺乳动物中，sirtuins蛋白家族有7个成员，有不同的亚细胞定位及功能［3］。SIRT1、6、7主要定位于细胞核，SIRT3-5主要定位于线粒体，SIRT2主要定位于细胞质［4］。SIRT1是研究最多的成员，其活化后不仅能去乙酰化及甲基化修饰组蛋白，还能与多种非组蛋白相互作用，参与多种细胞生理、病理过程，如细胞衰老凋亡、寿命延长、DNA损伤修复、肿瘤发生、抗氧化应激、能量代谢调节等［4］。尽管有研究认为SIRT1可以作为肿瘤抑制因子发挥作用，但越来越多的研究结果显示，SIRT1在许多人类恶性肿瘤中阳性表达均上调［5～10］。为了证实SIRT1在直肠癌组织中的表达情况，本研究通过免疫组化方法检测SIRT1在直肠癌及癌旁正常直肠组织中的表达，结果显示SIRT1在直肠癌中表达明显高于癌旁正常直肠组织，差异具有显著性统计学意义（P＜0.05），提示SIRT1的高表达可能在直肠癌的发生发展中起重要作用。

SIRT1在许多肿瘤组织中高表达，如卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌［7］，研究发现SIRT1可从以下几个方面参与肿瘤的发生、发展、耐药及影响预后：（1）通过直接去乙酰化作用，调节癌基因及抑癌基因的表达，促进细胞增殖，这可能是SIRT1参与肿瘤形成的主要机制。如SIRT1通过对P53蛋白382赖氨酸的去乙酰化，使P53蛋白不稳定，延长细胞的生存，促进细胞增殖［11］。（2）通过翻译后修饰作用，影响一些转录因子的转录活性，包括DNA结合力、亚细胞定位及募集共转录因子的能力［7］，从而调控这些转录因子下游产物的表达及相应的生物学功能。（3）SIRT1调节表皮间质转化被认为是一个促进肿瘤细胞侵袭和迁移可能机制。有研究报道：在肿瘤生长因子β诱导的表皮间质转化的乳腺癌细胞中SIRT1表达上调［12］，沉默SIRT1能够恢复细胞间的链接，降低细胞的侵袭性［13］。（4）SIRT1过表达导致一些肿瘤获得多种耐药性，该现象已在多种多药耐药癌细胞株中得到证实［14］。

本研究结果表明直肠癌组织中SIRT1的表达与肿瘤的TNM分期，浸润深度、淋巴结转移呈正相关，而与组织的分化程度呈负相关，提示TNM分期越晚、浸润肌层、有淋巴结转移及分化程度越低的患者相应肿瘤组织中SIRT1表达阳性率越高。Zheng［15］及Kang等［16］研究表明，SIRT1过表达组的癌症患者预后较差，且总生存期较短。Zhao等［10］，Cha等［17］研究胃癌、胰腺癌中SIRT1高表达与肿瘤高分级及淋巴结转移相关。Liang等［18］对大肠癌的研究发现，SIRT1表达与肿瘤高分级、淋巴结转移、肝转移及不良预后相关。本研究结果与上述研究结果趋势一致。但是也有研究表明SIRT1在大肠癌及转移灶中表达较正常组织低［19］，可能SIRT1在不同的组织中有不同的生物学功能，导致出现矛盾的临床结果。本研究结果显示SIRT1在直肠癌肿瘤组织中高表达，且与肿瘤的浸润深度，淋巴结转移，TNM分期及肿瘤分化密切相关。本研究肿瘤分化组的高分化及低分化的组织例数较少，分组不平衡，可能出现偏倚。

综上，SIRT1可能在直肠癌发生发展中起重要作用，有可能成为直肠癌判断预后的一个重要指标。针对SIRT1相关生物学行为，干扰SIRT1表达，阻断SIRT1相关信号通路，或沉默其基因表达，可能抑制肿瘤的发生及发展，从而提高治疗直肠癌的疗效，这一设想还需进一步研究证实。

［1］Haigis MC，Sinclair DA.Mammalian sirtuins：biological insights and disease relevance［J］.Annu Rev Pathol，2010，5：253-295.

［2］Imai S，Armstrong CM，Kaeberlein M，et al.Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase［J］.Nature，2000，403（6771）：795-800.

［3］Houtkooper RH，Pirinen E，Auwerx J.Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13（4）：225-238.

［4］Moore RL，Dai Y，Faller DV.Sirtuin 1（SIRT1）and steroid hormone receptor activity in cancer［J］.J End Inolo，2012，213（1）：37-48.

［5］Nakane K，Fujita Y，Terazawa R，et al.Inhibition of cortactin and SIRT1 expression attenuates migration and invasion of prostate cancer DU145 cells［J］.Int J Urol，2012，19（1）：71-79.

［6］Jang KY，Kim KS，Hwang SH，et al.Expression and prognostic signi fcance of SIRT1 in ovarian epithelial tumors［J］.Pathology，2009，41（4）：366-371.

［7］Chen HC，Jeng YM，Yuan RH，et al.SIRT1 promotes tumorigenesis and resistance to chemotherapy in hepatocellular carcinoma and its expression predicts poor prognosis［J］.Ann Surg Oncol，2012，19（6）：2011-2019.

［8］Lee SH，Um SJ，Kim EJ.CBX8 suppresses Sirtinol-induced premature senescence in human breast cancer cells via cooperation with SIRT1［J］.Cancer Lett，2013，335（2）：397-403.

［9］Kang Y，Jung WY，Lee H，et al.Expression of SIRT1 and DBC1 in Gastric Adenocarcinoma［J］.Korean J Pathol，2012，46（6）：523-531.

［10］Zhao G，Cui J，Zhang JG，et al.SIRT1 RNAi knockdown induces apoptosis and senescence，inhibits invasion and enhances chemosensitivity in pancreatic cancer cells［J］.Gene Ther，2011，18（9）：920-928.

［11］Zhao WH，Kruse JP，Tang Y，et al.Negative regulation of the deacetylase SIRT1 by DBC1［J］.Nature，2008，451（7178）：587-590.

［12］Eades G，Yao Y，Yang M，et al.miR-200a regulates SIRT1 expression and epithelial to mesenchymal transition（EMT）-like transformation in mammary epithelial cells［J］.J Biol Chem，2011，286（29）：25992-26002.

［13］Byles V，Zhu L，Lovaas JD.et al.SIRT1 induces EMT by cooperating with EMT transcription factors and enhances prostate cancer cell migration and metastasis［J］.Oncogene，2012，31（43）：4619-4629.

［14］Zhu H，Xia L，Zhang Y，et al.Activating transcription factor 4 confers a multidrug resistance phenotype to gastric cancer cells through transactivation of SIRT1 expression［J］.PLoS One，2012，7（2）：e31431.

［15］Lin ZH，Fang DY.The roles of SIRT1 in cancer［J］.Genes Cancer，2013，4（3-4）97-104.

［16］Kang Y，Jung WY，Lee H，et al.Expression of SIRT1 and DBC1 in gastric adenocarcinoma［J］.Korean J Pathol，2012，46（6）：523-531.

［17］Cha EJ，Noh SJ，Kwon KS，et al.Expression of DBC1 and SIRT1 is associated with poor prognosis of gastric carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2009，15（13）：4453-4459.

［18］Liang Lv，Shen Z，Zhang J，et al.Clinicopathological significance of SIRT1 expression in colorectal adenocarcinoma［J］.Med Oncol，2014，31（6）：965.

［19］Jang SH，Min KW，Paik SS，et al.Loss of SIRT1 histone deacetylase expression associates with tumour progression in colorectal adenocarcinoma［J］.J Clin Pathol，2012，65（8）：735-739.

（编辑 裘孝琦）

Expression and ClinicalSignificance of Sir2-related Enzymes-1 in ColorectalCancer

QIXiao-ying，JIANGZhong-xiu，LIUYang，LINing，ZHANGXiao-ye
（DepartmentofOncology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110022，China）

Objective To investigate the expression and clinical significance of Sir2-related enzymes-1（SIRT1）in colorectal cancer.MethodsThe expression of SIRT1 was evaluated by immunohistochemistry in 86 selected cases of primary Colorectal cancer and 30 samples of normal rectum tissues besided carcinoma.The relationship of the expression and clinical pathological features were analyzed.ResultsThe positive expression rate of SIRT1 in Colorectal cancer tissue was 88.4%，and significantly higher than in normal rectum tissue besided carcinoma（P＜0.001）.There were no correlation between the expression ofSIRT1 and sex，age and tumordiameter，and significantpositive correlation between the expression ofSIRT1 and TNM stage（P＜0.05），lymph node metastasis（P＜0.05），infiltrating depth（P＜0.05），and negagtive correlation between the expression of SIRT1 and tumor differentiation（P＜0.05）.ConclusionThe positive expression rate of SIRT1 in colorectal cancer tissue was significantly higher than in normal rectum tissue besided carcinoma and intimate correlation with tumor differentiation，TNM stage，lymph node metastasis and Infiltrating depth.ConclusionSIRT1 may be an importantassistance gene to diagnose and judge prognosis，and may improve diagnostic rate and auxiliarily judge prognosisasa importantColorectalcancermarker.

Sir2-related enzymes-1；colorectal cancer；immunohistochemistry

R735.3

A

0258-4646（2015）07-0606-05

辽宁省自然科学基金（2014021032）

齐晓莹（1985-），女，医师，硕士.

张晓晔，E-mail：zhangxy1@sj-hospital.org

2015-04-17

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