猪丹毒检测方法的对比与分析

刘俐君，张 见，赵小波，林 洁，田益明，邢云云

（1.四川省达州市动物疫病预防控制中心四川达州635000；2.南京仕必得生物技术有限公司江苏南京211000）

猪丹毒检测方法的对比与分析

刘俐君1，张 见2，赵小波2，林 洁2，田益明2，邢云云1

（1.四川省达州市动物疫病预防控制中心四川达州635000；2.南京仕必得生物技术有限公司江苏南京211000）

猪丹毒是由猪丹毒杆菌引起的，通常与生产中的猪只高死亡率和低生长性能息息相关。由于该病的持续传播，世界范围内大约有30%～50%的生猪在扁桃体和淋巴结都携带有丹毒杆菌。近年来，猪丹毒在我国大有卷土重来的趋势，虽然实验证明青霉素类和头孢类抗菌药物对猪丹毒仍有显著疗效，使用猪丹毒G4T10株弱毒疫苗也可产生有效的免疫保护力，但猪丹毒往往呈急性经过，且无特征性病理变化，导致不能及时对症治疗，免疫失败更是时常发生。所以只有实时监测疫苗免疫效果和及时进行早期诊断才能有效防治猪丹毒。本文就猪丹毒的检测方法研究进展进行了简要概述。

1 猪丹毒的检测样品

猪群可以通过摄入污染的饲料和水或者皮肤擦伤感染猪丹毒。亚临床感染猪被认为是猪丹毒急性暴发的容器，一旦感染，动物就会通过粪便、尿液、唾液和鼻腔分泌物散布该菌，并且能成功分离到丹毒杆菌。其分布数量与病程和器官特性有关。根据猪丹毒杆菌在各脏器的分布情况，通常采取病猪的血液、肾脏、脾脏、肝脏、心血、淋巴结、病变关节、病变皮肤、扁桃体等进行细菌分离鉴定。有研究表明，病料中以肾脏的分离率最高。但通常采集病猪血液或血清进行检测居多。另外血浆样本也可替代血清样本，Eric J.等（2008）经ELISA试验检测猪丹毒抗体的研究发现，血清和血浆的OD值没有显著差异。口腔液体也可作为诊断和监测样本。Luis G等（2013）通过悬挂棉绳采集猪唾液成功用于猪丹毒检测方法的比对。相对于血清样本，该取样方法一个人便可以操作，对人没有攻击性，猪亦没有应激反应，成本相对低，有利于大量监测研究和多个病原体的研究的采样。

2 猪丹毒的检测方法

由于猪丹毒对养猪生产造成的危害较大，所以用于猪丹毒诊断、免疫评价及监测的方法研究从未间断。常用的是从可疑病灶进行细菌分离，但是由于猪丹毒杆菌菌落小，生长缓慢以及频繁的污染，猪丹毒杆菌很难被分离，加上抗生素的大量使用，临床采集样品也不容易分离出病原体。因此寻找更为先进、简便快速、敏感特异的检测方法的研究工作仍在继续。

3.1 凝集试验

凝集试验中，由于凝集价与机体的免疫力有较强的相关性，培养凝集试验经多次改进后广泛用于动物血清抗体的检测和疫苗免疫效果的评价。多位研究者对培养凝集试验、血凝抑制试验和试管凝集试验的可靠性进行了比较，结果证明培养凝集试验能够确切反映出猪的免疫水平，并且能区分免疫猪和非免疫猪。另外有试验证明，间接血凝试验与培养凝集试验同样可靠，并且有快速的特点。由此法改进的反向间接血凝试验也同样特异、敏感，其检出率从85.7%至100%不等。但该试验对条件要求严格，必须提供高免血清，采样等需无菌操作。

3.2 沉淀试验

沉淀试验主要用作该菌血清型的鉴定。我国学者马闻天（1963）、崔治中（1979）、杨玮云（1983）、佘永建（1984）等也先后成功用此法进行了菌株的血清型鉴定。而日本赤泽（1952）曾试图用此法进行临床诊断，但发现难以区分病猪与健康猪，因此中断应用。

3.3 变态反应试验

猪丹毒杆菌系兼性胞内寄生菌，能刺激机体产生心内膜炎和关节炎等变态反应，变态反应诊断法

由此而来。虽有试验证明该病能产生炎性反应，但也有学者认为其诊断结果不准确，所以未广泛使用。

3.4 补体结合试验

自补体结合试验创建后，Bercorich等改进了抗原的制法，建立了一种在V型微量滴定板上进行的补体结合试验。此法可以区分临床感染猪与预防接种猪，并在数小时内得出结果，比生长抑制试验具有更高的敏感性和特异性。

3.5 酶免疫试验

Kirchhoff首创间接酶免疫试验用于检测试验感染猪和鼠血清以及田间采集猪血清样品中的猪丹毒抗体。在此基础上，多位学者对ELISA的包被抗原进行了改进。Sato,H等提纯猪丹毒64 kDa蛋白抗原用于ELISA，其结果和乳胶凝集试验及生长凝集试验结果高度一致，证明ELISA可以用于监测抗体的动态变化。Imada采用猪丹毒表面蛋白SpaA416作为抗原建立ELISA成功用于疫苗接种的保护性抗体、母源抗体和感染性抗体的监测。肖国生等以猪丹毒CD3004(1a型)和C43-12(2型)菌株为抗原提取菌株，EDTA渗透法提取的抗原作为膜载抗原，创建了Dot－PAA－ELISA检测猪丹毒抗体。作者认为适合基层检疫单位和养猪企业用于猪群免疫监测和猪丹毒流行病学调查。Luis G认为以rSPaA415抗原建立的ELISA比商业的试剂盒更敏感。

3.6 免疫组化试验

已有研究者用免疫组化方法（IHC）从试验攻毒猪丹毒杆菌的猪关节中检测出抗原，但未得到推广。为将这种方法作为常规诊断手段，Tanja等用IHC法检测石蜡组织切片上的猪丹毒抗原，证明此法具有高度的特异性和敏感性。对于经抗生素治疗的动物病料或皮肤损伤中的猪丹毒抗原，细菌分离培养为阴性时尤其实用。

3.7 荧光免疫试验

多数学者认为荧光抗体检测法特异性强，敏感性高，检验时间短，但早年因其方法复杂未广泛应用。宣华等（1982）用直接荧光法检测病料中的丹毒丝菌，此法的敏感性仅次于或与培养和动物接种试验一样，而用时仅需1～2h。

微粒子免疫检测技术(microbead immuno assay， MIA)是一种微粒子及捕捉免疫荧光相结合的方法，此法可以检测蛋白质和核酸，具有敏感、特异、快速、稳定、高处理量、可进行多重测定、样品用量少的优势。Luis G.（2012）等在表面蛋白SPA的基础上重组多肽rSpaA415作为抗原，建立了荧光微粒子免疫检测技术（FMIA）用于检测抗猪丹毒的IgG抗体。结果显示该方法比传统的ELISA商业试剂盒更敏感，尤其是感染和免疫初期。它可以在一个反应孔里同时检测多个病原体或抗原的血清抗体。当筛选大量样品的时候，大大节省了人力和时间及成本。作者认为以rSpaA415为载体的荧光微粒体免疫检测技术作为ELISA的替代品具有良好的发展前景。

3.8 分子生物学方法

Makino S（1994）基于16S rRNA序列建立了PCR方法用于检测小鼠关节和脾脏中的丹毒杆菌，试验在6个小时内完成，能区别出E.Rhusiopathiae和E.Tonsillarum2个种属。奠定了猪丹毒杆菌分子生物学检测方法的基础。Takeshi K（1999）改进的PCR方法用于屠宰场猪丹毒的筛选，特异性强，能够区分4个种属的丹毒杆菌。从患病动物采样检测与分离培养方法相比，PCR检测在5个小时内完成，特异性和耗时都有所改进。

Pal,N（2009）等创建了多重RT-PCR方法用于检测试验攻毒和疑似自然感染猪猪丹毒杆菌，并且与传统PCR方法和富集分离培养法相比较，结果证明该方法简单、快速、重复性好，特异性强，敏感性高。与PCR方法比减少了DNA提取之前繁琐冗长的培养提取步骤，更有利于实验室快速检测诊断猪丹毒。

4 小结

猪丹毒的检测方法，除了准确性的要求，其临床实用性的要求也是至关重要的。只有选择合适的检测方法，才能有效的对该病进行监测和早期治疗。各种检测方法各有利弊，Luis G.（2013）等比较了细菌分离培养、ELISA、FMIA和RT-PCR四种方法，认为RT-PCR和FMIA两种方法结合是猪丹毒感染最好的监测或诊断方法。用RT-PCR和/或FMIA方法IgM检测为阳性，IgG阴性则认为是感染的急性阶段，仅有IgG阳性则认为是疾病的慢性阶段。因此，何种方法会在今后的临床应用中得到最为广泛的推广，还需要临床实践的进一步检验。■（编辑：狄慧）