乳腺癌BAG—1基因表达与表皮生长因子受体表达的相关性

杨辉　徐笑红

[摘要] 目的 探讨乳腺癌BAG-1基因表达与表皮生长因子受体（EGFR）表达的相关性。 方法 培养乳腺癌细胞株，采用实时聚合酶链反应技术检测EGFR（+）和EGFR（-）细胞株中BAG-1 mRNA的表达情况，West blot法检测其蛋白水平。分析BAG-1基因表达与EGFR表达的相关性。 结果 MDA-MB-231、T47D细胞株EGFR mRNA和EGFR蛋白阳性表达，MCF-7、SLBP3细胞株EGFR mRNA和EGFR蛋白阴性表达。T47D细胞株BAG-1 mRNA的表达水平最高[（29.6±0.4）×10-4]，其次为MDA-MB-231细胞株[（6.9±0.3）×10-4]，两者的表达水平均显著高于MCF-7细胞株[（4.3±0.5）×10-4]、SKBR3细胞株[（0.3±0.1）×10-4]，差异的有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 BAG-1表达与EGFR存在相关性，可作为乳腺癌靶向治疗的潜在靶点。

[关键词] 乳腺癌；表皮生长因子受体；B淋巴细胞瘤-2基因相关抗凋亡基因

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）12（c）-0025-05

Correlation of BAG-1 gene expression and EGFR expression in breast cancer

YANG Hui1 XU Xiaohong2

1.Center of Tumor Radiation and Chemotherapy， Yinzhou People's Hospital of Ningbo City， Zhejiang Province， Ningbo 315000， China； 2.The Center of Tumor Radiation， Zhejiang Provincial Tumor Hospital， Zhejiang Province， Hangzhou 310022， China

[Abstract] Objective To discuss the correlation of BAG-1 gene expression and EGFR expression in breast cancer. Methods Breast cancer cell lines were cultured， BAG-1 mRNA expression was detected by PCR in EGFR （+） and EGFR （-） cell lines. BAG-1 protein expression was detected by West blot. Correlation of BAG-1 gene expression and EGFR expression in breast cancer was analyzed. Results EGFR mRNA and EGFR protein were positive expression in EGFR MDA-MB-231 and T47D cell lines， and negative expression in MCF-7 and SLBP3 cell lines. BAG-1 mRNA expression was highest in T47D cell line [（29.6±0.4）×10-4]， followed by MDA-MB-231 cell line [（6.9±0.3）×10-4]. Both expression levels were significantly higher than that of MCF-7 cell line [（4.3±0.5）×10-4] and SKBR3 cell line [（0.3±0.1）×10-4]， the differences were statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Expression of BAG-1 shows correlation with EGFR， which can be used as a potential targets for targeted therapy of breast cancer.

[Key words] Breast cancer； EGFR； BAG-1

乳腺癌是外科常见肿瘤，威胁女性的健康。近年来随着筛查方法的不断发展，早期乳腺癌的检出率和治愈率逐渐升高，患者的生存时间也逐渐延长。综合治疗的发展极大地提高了乳腺癌的治疗效果。乳腺癌靶向治疗的分子靶点主要有人类表皮生长因子受体-2（epidermal growth factor receptor，EGFR-2）及EGFR[1-2]。EGFR属于表皮生长因子家族成员之一，是一种跨膜蛋白，由原癌基因c-erbB编码，具有抑制细胞凋亡，促进肿瘤血管化、促进细胞增殖等作用，能够加快肿瘤的浸润和转移[3-4]。BAG-1是一种抗凋亡基因，编码一种多功能结合蛋白，与细胞多种蛋白结合，调节细胞内的信号传导、转录、增殖、分化以及凋亡等[5]。BAG-1的过表达可抑制细胞凋亡，包括放疗、化疗等诱发的细胞凋亡，导致癌细胞对治疗耐受。研究显示采用siRNA技术降低肺癌中BAG-1的表达，结果EGFR基因及蛋白的表达升高，提示二者存在一定的相关性[6]。本研究分析乳腺癌肿BAG-1基因表达与EGFR表达的相关性，并分析其对乳腺癌靶向治疗的影响。现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

乳腺癌细胞株EGFR（+）株MDA-MB-231、T47D和EGFR（-）株SKBR3、MCF-7。细胞培养液、胎牛血清、胰蛋白酶由Hyclone公司提供。四甲基乙二胺、甘氨酸、预染蛋白Marker、丙烯酰胺、ECL显影液、PVDF膜，一抗兔抗BAF-1抗体、抗β-actin抗体、抗EGFR、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗均购自美国CST公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养

从冰箱中取出细胞后进行细胞复苏。观察细胞长满培养瓶的平底壁时，倒掉培养液，冲洗后，胰蛋白酶消化，37℃孵育3 min，观察细胞变圆、间隙变大时，加入RPMI-1640培养液终止消化，细胞分瓶培养。

1.2.2 实时聚合酶链反应（Real-time PCR）检测EGFR mRNA和BAG-1 mRNA的表达

1.2.2.1 总RNA提取 （5～10）×106个细胞中加Trizol 1 mL，吹吸裂解后室温静置5 min。取出匀浆，加氯仿200 μL，混匀，4℃下12 000 r/min 离心15 min。取上层，加等体积的异丙醇，混匀，室温下放置10 min，4℃下12 000 r/min离心10 min。弃上清，加75%乙醇1 mL，4℃，7500 r/min离心5 min，弃上清。晾干后加DEPC 20 μL溶解。

1.2.2.2 逆转录合成cDNA 反应体系5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix1 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，Total RNA 1 μg，RNase Free dH2O加至反应体系体积20 μL，条件37℃，15 min，85℃ 5 s。-20℃冰箱保存。

1.2.2.3 PCR扩增 采用预混试剂Premis Taq扩增。94℃预变性5 min，94℃变性30 min，BAG-1 57℃退火30 min，EGFR 58℃退火30 min，7℃延伸15 min，72℃延伸10 min，进行35个循环。BAG-1产物片段160 bp，EGFR产物片段163 bp，β-actin产物片段205 bp。1.5琼脂糖将凝胶电泳验证PCR产物。

1.2.2.4 Real-time PCR 反应液体系20 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，目的基因上游引物0.4 μL， 下游引物0.4 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。94℃预变性30 s，94℃变性5 s，57℃退火30 s，变性和退火进行39个循环。溶解曲线65～95℃。分析结果，根据实时荧光定量PCR相对定量检测方法。

1.2.3 Western blot 法检测EGFR蛋白和BAG-1蛋白表达

倒掉细胞培养液，PBS液冲洗3次，每孔加裂解液80 μL，在冰面上晃动6孔板10次，细胞充分裂解，将蛋白吸入到EP管中，100℃水浴10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清至EP管内，检测蛋白浓度。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，灌注凝胶后，上样，恒流20 mA电流电泳，转膜，封闭，加一抗，4℃过夜，TBST洗5～10 min，重复3次，加二抗，室温1 h，TBST洗5～10 min，重复3次。显影，曝光。EGFR呈棕黄色颗粒，主要定位在细胞浆或细胞膜。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，不同细胞株间BAG-1 mRNA、EGFR mRNA及其蛋白表达水平比较采用采用F检验和t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同细胞株EGFR mRNA以及EGFR蛋白表达情况

图1结果显示，MDA-MB-231、T47D细胞株EGFR mRNA阳性表达，MCF-7、SLBP3细胞株EGFR mRNA不表达。图2结果显示T47D细胞、MDA-MB-231细胞株EGFR蛋白强表达，MCF-7、SLBP3细胞株EGFR蛋白阴性表达。

1为MCF-7细胞株β-actin；2为MDA-MB-231细胞株β-actin；3为SLBP3细胞株β-actin；4为T47D细胞株β-actin；5为MCF-7细胞株EGFR mRNA；6为MDA-MB-231细胞株EGFR mRNA；7为SLBP3细胞株EGFR mRNA；8为T47D细胞株EGFR mRNA；EGFR：表皮生长因子受体

图1 不同细胞株EGFR mRNA水平

1为T47D细胞株；2为MDA-MB-231细胞株；3为MCF-7细胞株；4为SKBR3细胞株

图2 不同细胞株表皮生长因子受体蛋白水平

2.2 EGFR（+）和EGFR（-）细胞株BAG-1 mRNA以及蛋白表达

EGFR（+）和EGFR（-）细胞株BAG-1 mRNA T47D细胞株BAG-1 mRNA的表达水平最高，其次为MDA-MB-231细胞株，两者的表达水平均显著高于MCF-7和SKBR3细胞株。△CT值：T47D细胞株与MDA-MB-231及MCF-7及SKBR3细胞株比较，差异均有高度统计学意义（t = 14.8、19.8、36.3，P < 0.01）；MDA-MB-231细胞株与MCF-7及SKBR3细胞株比较，差异均有高度统计学意义（t = 3.7、20.6，P < 0.01）；MCF-7细胞株比与SKBR3细胞株比较，差异有高度统计学意义（t = 17.4，P < 0.01）。mRNA表达量：T47D细胞株与MDA-MB-231、MCF-7及SKBR3细胞株比较，差异均有高度统计学意义（t = 101.5、88.4、158.9，P < 0.01）；MDA-MB-231细胞株与MCF-7及SKBR3细胞株比较，差异均有高度统计学意义（t = 9.9、46.7，P < 0.01）；MCF-7细胞株比与SKBR3细胞株比较，差异有高度统计学意义（t = 17.5，P < 0.01）。见表1，图3、4。

表1 不同EGFR表达水平细胞BAG-1 mRNA表达量比较

注：△CT值=BAG-1 CT值-βactin CT值；EGFR：表皮生长因子受体

1为MDA-MB-231细胞β-actin；2为MCF-7细胞β-actin；3为SKBR3细胞β-actin；4为T47D细胞β-actin；5为MDA-MB-231细胞；6为MCF-7细胞；7为SKBR3细胞；8为T47D细胞

图3 EGFR（+）和EGFR（-）细胞株BAG-1 mRNA表达

1为MDA-MB-231细胞株；2为MCF-7细胞株；3为SKBR3细胞株；4为T47D细胞株

图4 不同ERGF表达水平的细胞株BAG-1蛋白表达水平

3 讨论

乳腺癌是临床常见肿瘤，主要以女性为主，严重威胁女性的生活质量及生命健康。随着检测方法的不断发展，其检出率在逐渐上升，并且早期乳腺癌的检出率越来越高，为根治手术提供了可能。目前，临床上根治乳腺癌的方法主要是手术治疗，术后辅以化疗以及内分泌治疗。化疗缺乏靶向性，不良反应较严重，造成医疗资源的浪费，还可导致耐药的发生，甚至产生不可逆的副作用，而导致治疗失败。目前学界的研究方向是试图找到在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用的分子，通过针对性的靶向治疗，提高疗效，降低不良反应。目前乳腺癌靶向治疗的靶点包括催乳素受体（PR）、雌激素受体（ER）、人类表皮受体（Her-2）等。目前针对PR、ER、Her-2的治疗已经实现了个体化治疗，能够显著延长患者的无病生存期以及总生存率[7-9]。但是研究显示，Herceptin单药治疗Her-2阳性的乳腺癌患者的有效率较低，仅为15%～30%[10]。这提示已经明确的靶向治疗的靶点外，还存在其他与靶点相互作用的分子，影响了靶向治疗的效果。

EGFR与Her-2均属于表皮生长因子家族，根据结构功能分为4种类型，调节细胞的增殖、分化和存活。EGFR是一种跨膜蛋白，编码的蛋白具有酪氨酸激酶活性[11-12]。EGFR分为细胞内区、跨膜区以及细胞外区。细胞外由621个氨基酸残基，是受体部位，跨膜区由23个氨基酸残基，细胞内分为近膜区与激酶区。转化生长因子α、表皮生长因子、表皮素等配体与受体部位结合，相互作用，形成同源二聚体或者异源二聚体，跨膜区发生变化，激活细胞内的酪氨酸激酶，其与ATP酶结合，发生自身磷酸化及转磷酸化从而促使底物水平磷酸化，产生级联反应，信息传入细胞核，促进肿瘤血管化形成及细胞增殖，甚至促进肿瘤的局部浸润以及远处转移等[13-15]。EGFR在上皮性肿瘤存在高表达，往往恶性程度高、预后差。本次研究结果显示乳腺癌T47D细胞株和MDA-MB-231细胞株中EGFR mRNA以及EGFR蛋白呈现高表达，尤其以T47D细胞株的表达最高。

基底样型乳腺癌不表达PR、ER和Her-2/neu，但是表达EGFR，对患者的预后具有预测作用。BLBC亚型缺乏具有针对性的靶点，容易发生转移和复发，预后差。而将EGFR作为靶点可能是有效的治疗途径。EGFR的高表达与乳腺癌患者针对ER和PR的内分泌治疗的耐药具有一定的相关性[16-18]。而在针对ER和PR的内分泌治疗中联合吉非替尼可延缓耐药情况的出现。EGFR络氨酸激酶抑制剂的耐药机制可能包括EGFR发生突变、c-MET扩增、Her-2突变、上皮细胞向间质转化、PTEN信号通路作用、胰岛素样生长因子的表达、KRAS基因发生突变等。EGFR TK区发生突变影响吉非替尼的敏感性。EGFR第20号外显子的突变与抑制TKIs作用降低有关。EGFR外显子20 790密码子的突变，与EGFR-TKI的耐药有关。c-MET的扩增依赖Her-3活化的PI3K信号通路。研究显示，Her-2发生突变的患者对EGFR TKI耐药，但对针对Her-2的靶向治疗仍然敏感。去除Her-2后，对EGFRTKI的敏感性恢复，说明Her-2的突变与EGFR的靶向治疗耐药有关。因此在临床工作中可以考虑联合抗Her家族抗体治疗。PTEN通路能够下调Akt基因，从而促进细胞凋亡。PTEN功能丧失，Akt呈现过度表达，导致抵抗凋亡，产生针对EGFR TKI的耐药。胰岛素样生长因子-1的表达与吉非替尼的敏感性呈负相关。KRAS是EGFR信号通路的下游分子，其突变影响EGFR的靶向治疗，是导致EGFR TKI的耐药机制之一。

BAG-1属于抗凋亡基因，属于共分子伴侣家族，其编码的蛋白与细胞的多部位靶点结合，具有多种功能[19-20]。BAG-1 mRNA翻译的起始点不同，获得的亚型也不同，不同亚型在结构、功能、细胞内定位等均存在一定的差异。L亚型N端有定位信号，定位于细胞核，M亚型存在于细胞质和细胞核中，BAG-1S与p29存在于细胞质中。BAG-1的四个亚型均具有共同的C末端结构域以及泛素样结构域，这些结果对细胞维持生长发挥重要的作用。BAG结构域介导BAG-1和热休克蛋白（HSP）发挥作用，恢复变性蛋白的作用。BAG的结构域还与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶相互作用介导细胞内的信号传导。BAG-1泛素样结构域在BAG-1蛋白酶复合物的形成过程中发挥重要的作用。BAG-1参与抑制细胞的凋亡以及应激反应，其与不同分子位点结合而发挥抗凋亡的作用，其与热休克蛋白结合可抑制因放疗、化疗、细胞表面死亡分子活化、热休克等导致的细胞凋亡[21]。BAG-1属于共分子伴侣家族成员，直接与分子伴侣HSP70以及HSC70结合，刺激ATP酶活性，改变HSP70与底物的亲和力。BAG蛋白可直接激活RAF-1而传递细胞信号。其还在其他细胞信号传导过程中发挥作用。BAG-1可直接与配体依赖性转录因子NHR结合，并调节其功能，影响细胞的转录活性。BAG-1还可ER等结合并调节其活性。BAG-1可偶联分子伴侣和蛋白酶复合体，调节蛋白折叠和降解平衡。BAG-1与乳腺癌的发生发展有关，其在正常的乳腺组织中并不表达，但是在乳腺癌中却可高表达。

在本次研究中，EGFR（+）的乳腺癌细胞株BAG-1也存在高表达，而EGFR（-）的乳腺癌细胞株中BAG-1也呈现低表达或不表达，因此推测乳腺癌组织EGFR的表达与BAG-1的表达具有一定的相关性。理论上BAG-1可以作为治疗靶点，通过抑制BAG-1，从而降低其对细胞凋亡的抑制以及细胞核激素功能的调节作用，从而促使肿瘤细胞的凋亡，达到抑制肿瘤的目的。从本次研究结果也显示BAG-1与EGFR具有一定的相关性，而EGFR是重要的靶向治疗的靶点，如果将BAG-1作为靶向治疗的靶点，可以达到降低患者耐药的情况，获得更好的治疗效果。研究显示，在肠癌中，BAG-1是EGFR的调节基因，位于EGFR启动子部位的DNA复合物中，用siRNA降低BAG-1的表达，可以显著提高EGFR的表达水平，从而增加以EGFR为靶点抗癌药物的治疗效果[22]。有研究在乳腺癌发现BAG-1与EGFR的表达具有相关性，并且通过siRNA技术降低BAG-1水平，能够升高EGFR水平，并且该项研究还比较干预前后细胞对针对EGFR靶向治疗的吉非替尼药物的治疗耐受情况，结果显示，干预后吉非替尼对细胞的抑制率显著升高，这也提示，理论上将BAG-1作为靶向治疗，降低乳腺癌小中BAG-1的表达，从而升高EGFR的表达，能够提高靶向治疗的效果[23]。

综上所述，BAG-1抑制细胞的凋亡，其表达与EGFR的表达存在一定的相关性。EGFR阳性表达的乳腺癌细胞株中BAG-1也呈现高表达，提示BAG-1可以作为乳腺癌靶向治疗耐药的靶点。本研究因条件有限，对BAG-1与EGFR相互的作用机制没有进行进一步研究，期望在今后的研究中能够进一步明确其相互作用的机制。

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（收稿日期：2014-09-26 本文编辑：任 念）