Fas及Fas-L对小梁切除术后成纤维细胞的凋亡研究*

黎宗汉谭思敏柯 毅彭红娟

Fas及Fas-L对小梁切除术后成纤维细胞的凋亡研究*

黎宗汉①谭思敏①柯 毅①彭红娟①

目的：探讨Fas及Fas-L对小梁切除术后成纤维细胞凋亡的影响。方法：选取健康白兔20只，随机分为对照组和观察组，每组各10只，分别切下两组白兔带结膜、筋膜、巩膜及角膜缘的滤过手术区组织，进行成纤维细胞的培养，其中观察组进行青光眼小梁切除术。随机选取两组中各5例成纤维细胞进行FasMcAb处理，使用PI染色、流式细胞仪检测所有细胞凋亡率。结果：经FasMcAb处理的正常成纤维细胞凋亡率远高于未经FasMcAb处理的正常成纤维细胞，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）；经FasMcAb处理的青光眼小梁切除术滤过区组织成纤维细胞凋亡率远高于未经FasMcAb处理的青光眼小梁切除术滤过区组织成纤维细胞，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）；经FasMcAb处理的青光眼小梁切除术滤过区组织成纤维细胞凋亡率大于正常成纤维细胞，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论：Fas/Fas-L能够加速小梁切除术后成纤维细胞凋亡，可为减少青光眼小梁切除术后瘢痕化寻找一个新的突破口。

Fas； FasMcAb； 小梁切除术； 成纤维细胞； 凋亡

青光眼是全球主要的不可逆性的致盲性眼病之一，居第2位，是世界防盲治盲的重点工作之一[1]。尽管治疗青光眼上出现了新的技术和技术改进，小梁切除术仍然是最主要的治疗方式，但其远期手术成功率并不理想，滤过泡瘢痕化是小梁切除术失败的重要原因[2]。为了解决滤过泡瘢痕化的问题，人们通过使用抗代谢药物、基因治疗、激光微创治疗、生物合成材料等方法，但均未得到满意效果[3-4]。临床常用的抗代谢药物及抗细胞增殖药物5-氟尿嘧啶及丝裂霉素等在应用于手术很大程度上提高了手术成功率。但由于使用此类药物导致的如角膜损害、滤过泡渗漏、眼内感染、黄斑水肿等并发症的发生率也相应增加，将会给患者带来新的威胁，再次手术疗效欠佳，且明显增加了患者心理、经济的负担[5-7]。

Fas介导的凋亡被认为是介导死亡信号传递的主要通道，Fas及其信号转导蛋白的异常参与了多种疾病的发病过程，近来引起众多学者的重视[8-9]。本研究对Fas/Fas-L在小梁切除术后对成纤维细胞凋亡的影响进行探讨，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取广东双林生物制药有限公司的健康白兔20只，随机分为对照组和观察组，每组各10只，分别切下两组白兔带结膜、筋膜、巩膜及角膜缘的滤过手术区组织，进行成纤维细胞的培养，其中观察组进行青光眼小梁切除术。随机选取两组中各5例成纤维细胞进行FasMcAb处理，共分为四组，分别为正常细胞对照组、正常细胞+FasMcAb组、青光眼小梁切除术滤过区组织组及青光眼小梁切除术滤过区组织+FasMcAb组。

1.2 试剂与仪器 DMEM培养基为Gibco BRL公司产品，胎牛血清为Hyclone公司产品，碘化丙啶（PI）、RNase A为Sigma公司产品，流式细胞仪及FasMcAb（IgM型，7C11表位）为Beckman-Coulter公司产品。

1.3 成纤维细胞的培养 切除所有标本的表皮和皮下组织后在少量牛血清中切成1 mm3大小的组织块，并将其存入培养瓶中。在37 ℃，5％ CO2的饱和湿度条件下培养4～6 h，然后加入适量的DMEM培养基（含15％胎牛血清），3～4 d换液1次，2～3周后，至细胞长满并且汇合成片，消化于0.25％胰蛋白酶中，按1∶2～3的比例传代培养。此后每2～3 d换液1次，每3～5 d传代1次，实验用第8～10代细胞。

1.4 PI染色、流式细胞仪检测细胞凋亡率 分别取四组中处于指数生长状态下的细胞，接种于6孔细胞培养板中（1×105个/孔），两组FasMcAb处理组分别加入FasMcAb至浓度为100 ng/mL，继续培养48～72 h，至细胞密集长满孔底。消化细胞后以1000 r/min离心10 min，使用预冷PBS洗1遍，加入70％纯度的乙醇，于4 ℃固定过夜。过夜后低速离心10 min，PBS洗涤后，向剩余的0.5 mL细胞悬液加入RNase A 2 mL（20 g/L），37 ℃孵育0.5 h后快速投入冰水浴中停止RNase A作用，此时加入500 mL PI染液（100 mg/L）避光孵育0.5 h，经300目滤网过滤，使用流式细胞仪对所有成纤维细胞进行DNA分析，比较细胞凋亡率。

1.5 统计学处理 本文研究数据均采取SPSS 18.0统计学软件进行分析，计量资料采取（±s）表示，比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

经FasMcAb处理的正常成纤维细胞凋亡率（17.69±6.38）％远高于未经FasMcAb处理的正常成纤维细胞（5.15±1.32）％，两组比较差异具有统计学意义（t=8.65，P＜0.01）；经FasMcAb处理的青光眼小梁切除术滤过区组织成纤维细胞凋亡率（24.88±7.23）％远高于未经FasMcAb处理的青光眼小梁切除术滤过区组织成纤维细胞（4.25±0.33）％，两组比较差异具有统计学意义（t=9.25，P＜0.01）；非FasMcAb处理，正常成纤维细胞的凋亡率（5.15±1.32）％高于青光眼小梁切除术滤过区组织成纤维细胞的凋亡率（4.25±0.33）％，两组比较差异具无统计学意义（t=0.23，P＜0.05）；而经FasMcAb处理后，青光眼小梁切除术滤过区组织成纤维细胞的凋亡率（24.88±7.23）％高于正常纤维细胞的凋亡率（17.69±6.38）％，两组比较差异具有统计学意义（t=6.94，P＜0.01）。可见FasMcAb的确能够加速成纤维细胞的凋亡，并且对滤过区组织成纤维细胞凋亡影响大于正常成纤维细胞。

3 讨论

青光眼是指眼内压间断或持续升高的一种眼病，持续的高眼压可以给眼球各部分组织和视功能带来损害，如不及时治疗，视野可以全部丧失而至失明[10]。依据世界卫生组织资料推测，全球仅原发性青光眼患者就有6680万，而且患者逐年增加，我国仅原发性青光眼的患病率就达0.52％，50岁以上人群为2.07％，该病已成为严重影响我国人民身心健康和国民经济、社会发展和稳定的主要疾病之一[9]。目前小梁切除术仍是治疗青光眼的重要手段。但术后滤过泡易发生纤维瘢痕化，导致滤过功能丧失，使眼压再次升高，手术失败。滤过泡瘢痕化的机制尚不清楚，一般认为可能主要与除结膜成纤维细胞过度增生、凋亡受阻有关，随着细胞凋亡在各领域内研究的进展，这种受基因调控的程序性的细胞死亡，在瘢痕研究领域也越来越受到重视。

细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，而Fas/Fas-L途径是激活细胞凋亡的重要途径[11]。Fas又称CD95，是肿瘤坏死因子受体之一，是一种由325个氨基酸组成的跨膜蛋白受体分子。若Fas和配体Fas-L结合，Fas分子可启动致死性信号转导，从而引起细胞的多种特征性变化，导致细胞死亡。目前，对两者的研究已经成为生命科学领域研究的热点之一，研究发现Fas广泛表达于成纤维细胞和淋巴细胞等细胞表面，Fas-L主要表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞，也表达在睾丸、眼等免疫豁免部位[12-14]。Fas/Fas-L途径作为细胞凋亡激活途径，其表达水平的变化会导致一系列病理改变，Fas/Fas-L促进小梁切除术后成纤维细胞凋亡存在一定可行性[15]。然而目前国内外对滤过泡瘢痕组织的研究主要集中在成纤维细胞的增值影响因素及调节信号，对其凋亡的主要影响因子Fas/Fas-L的表达及意义的了解甚少。

在本研究中，笔者发现无论正常成纤维细胞或是青光眼小梁切除术滤过区组织成纤维细胞经FasMcAb处理后，其凋亡率显著增加，且FasMcAb对青光眼小梁切除术滤过区组织成纤维细胞的影响比正常成纤维细胞显著。Fas/Fas-L信号通路为调控伤口愈合与瘢痕形成的平衡提供可能，能够达到预防和治疗滤过泡瘢痕化的目的。

综上所述，Fas/Fas-L对小梁切除术后成纤维细胞凋亡影响显著，能够加快细胞凋亡，可为减少青光眼小梁切除术后瘢痕化寻找一个新的突破口，为寻找一种更加安全、特异、有效的抗瘢痕化方法提供新思路。

[1]梅锋，周琼.小梁切除术治疗青光眼术中应用生物羊膜“三明治”式植入的疗效及安全性[J].中国老年学杂志，2012，32（14）：2934-2936.

[2]刘亚丹，李军，陈红娟，等.小梁切除术联合应用丝裂霉C治疗青光眼疗效观察[J].山东医药，2010，50（2）：105-106.

[3]刘缅.小梁切除术联合丝裂霉素C对青光眼再手术的远期治疗价值[J].中国医学创新，2012，9（30）：23-24.

[4]李凤鸣.中华眼科学[M].第2版.北京：人民卫生出版社，2005：2.

[5]景金霞，哈少平.α-2b干扰素与5-氟尿嘧啶在青光眼滤过手术中抗瘢痕作用的对比研究[J].中华眼外伤职业眼病杂志，2011，33（4）：264-267.

[6]米娜瓦尔·阿不都，陈雪艺，具尔提·哈地尔，等.传统小梁切除术中使用丝裂霉素C与5-氟尿嘧啶疗效与安全性的系统评价[J].中国循证医学杂志，2010，10（6）：730-739.

[7]陈嘉莹，徐珊琪.小梁切除术后应用5-氟尿嘧啶对泪膜的影响[J].眼外伤职业眼病杂志，2003，25（3）：187-189.

[8] Kmi H S，Park C K.Retinal ganglion cell death is delayed by activationof retina l intrinsic cell survival program[J].Bra in Res，2005，1057（1-2）：17-28.

[9] Freiberg R A，Spencer D M，Choate K A，et al.Fas signal transduction triggers either proliferaton or apoptosis in human fibroblasts[J].J Invest Dermatol，1997，108（2）：215.

[10]绳伟东.我国原发性闭角型青光眼流行病学研究现状[J].中国实用医药，2014，9（23）：254-255.

[11]乔建平.三联术与单纯小梁切除术治疗原发性闭角型青光眼的疗效观察[J].中国医学创新，2011，8（25）：56-57.

[12]刘爱旗，夏璐.CCK-8法与MTT法检测兔成纤维细胞活性的比较研究[J].中国医学创新，2013，10（2）：12-13.

[13] Wang J A，Li C L，Fan Y Q，et al.Allograftic bone marrow-derived mesenchymal stem cells transplanted into heart infarcted model of rabbit to renovate infarcted heart[J].Zhejiang Univ Sci，2004，5（10）：1279-1285.

[14] Pak H N，Qayyum M，Kim D T，et al.Mesenchymal stem cell injection induces cardiac nerve sprouting and increased tenascin expression in a swinemodel ofmyocardial infarction[J].J Cardiovasc Electrophysiol，2003，14（8）：841-848.

[15] Niu Y J，Zhao Y S，Gao Y X，et al.Therapeutic effect of bFGF onretina ischemia-reperfusion injury[J].Chin Med J，2004，117（2）：252-257.

Research on Apoptosis of the Fibroblast Induced by Fas and Fas-L after Trabeculectomy/

LI Zong-han，TAN Si-min，KE Yi，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（10）：018-020

Objective： To explore apoptosis of the fibroblast induced by Fas and Fas-L after trabeculectomy. Method： A total of 20 healthy white rabbits were randomly divided into the control group and observation group，10 cases in each group，and the rabbits in the observation group were given glaucoma trabeculectomy.Two groups of tissues in trabeculectomy filtration area， which contain conjunctiva， anadesma， sclera and limbus corneae were cut down， and the fibroblasts of the tissues were cultivated. 5 cases of fibroblasts in each group were randomly selected and treated by FasMcAb. At last， PI staining and flow cytometry were used for testing the apoptotic rate of all the fibroblasts.Result： The apoptotic rate of normal fibroblasts induced by FasMcAb was higher than that of normal fibroblasts without induced by FasMcAb， the difference was statistically significant（P＜0.01）； the apoptotic rate of fibroblasts from tissues in trabeculectomy filtration area induced by FasMcAb was higher than that of fibroblasts from tissues in trabeculectomy filtration area without induced by FasMcAb，the difference was statistically significant（P＜0.01）；the effect of FasMcAb on the apoptotic rate of fibroblasts from tissues in trabeculectomy filtration area was more significant than that on normal fibroblasts， the difference was statistically significant（P＜0.01）.Conclusion：Fas/Fas-L can accelerate apoptosis of the fibroblast after trabeculectomy， and helps to find a new breakthrough to reduce the scar after glaucoma trabeculectomy.

Fas； FasMcAb； Trabeculectomy； Fibroblast； Apoptosis

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.10.006

2014-12-26） （本文编辑：周亚杰）

湛江市科技计划项目资助（2012C3103036）

①广东医学院附属医院 广东 湛江 524001

黎宗汉

First-author’s address：Guangdong Medical College Affiliated Hospital，Zhanjiang 524001，China