重组人促红细胞生成素对心肌梗死大鼠肿瘤坏死因子－α表达的影响

邢 军 白佳宁 蔡长华 (辽宁省人民医院麻醉科，辽宁 沈阳 006)

重组人促红细胞生成素对心肌梗死大鼠肿瘤坏死因子－α表达的影响

邢 军 白佳宁1蔡长华 (辽宁省人民医院麻醉科，辽宁 沈阳 110016)

目的 探讨重组人促红细胞生成素(rhEPO)对心肌梗死(MI)大鼠心肌肿瘤坏死因子(TNF)－α表达的影响。方法 45只SD大鼠，随机分为假手术组(Sham组)、MI组和rhEPO治疗组。用ELISA方法检测各组大鼠血清中TNF－α水平，RT－PCR方法检测梗死区及其周围心肌TNF－α mRNA表达变化。结果 MI组血清中TNF－α水平、梗死区及其周围心肌TNF－α mRNA表达显著高于Sham组(P＜0.05);与MI组相比，rhEPO治疗组血清中TNF－α水平、梗死区及其周围心肌TNF－α mRNA表达明显降低(P＜0.05)。结论 rhEPO可能通过下调TNF－α改善MI大鼠的心功能。

重组人促红细胞生成素;心肌梗死;肿瘤坏死因子－α

心肌梗死 (MI)时，心肌细胞出现不可逆的液化性坏死，丧失正常的泵血功能，最终可导致心力衰竭 (HF)的发生。目前对于MI的治疗方法，只能恢复梗死区早期再灌注改善心肌供血，但不能修复或逆转已坏死的心肌。促红细胞生成素 (EPO)是调节红细胞生成的糖蛋白，刺激骨髓的造血干细胞向红细胞分化〔1〕。EPO的生物学效应是通过激活特异性EPO受体并启动相应的信号传导途径来实现的〔2〕。重组人EPO(rhEPO)含有与天然分离的EPO完全相同的氨基酸序列，且具有相同的生物学活性，研究发现，它能够对机体供氧状况发挥重要的调控作用〔3〕，在临床应用EPO治疗贫血合并充血性HF患者，可观查到患者的心功能得到了显著改善〔4〕，但是其具体作用机制尚待进一步研究。肿瘤坏死因子(TNF)－α是体内的一个重要炎性因子，能够激发细胞因子网络，继而造成细胞因子的级联反应，进而诱生其他的炎性介质从不同的环节参与炎性反应，引起器官组织损伤，是炎症反应的一个重要启动因子〔5〕，研究发现，在人类HF中，抗TNF－α治疗可以减轻或逆转左室重塑和心室扩张〔6〕，但是，rhEPO能否通过调节TNF－α的表达参与MI的炎性机制尚未见文献报道，本研究观察MI大鼠的血清和梗死及周围区域组织的TNF－α的表达变化。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 rhEPO注射液(沈阳三生制药有限公司);大鼠TNF－α ELISA试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司)，DH－150动物人工呼吸机(浙江大学医学仪器厂)，Med lab－U/4CS生物信号采集仪(南京美易科技有限公司)，高速离心机(上海医用分析仪器厂)，OLYMPUS光学显微镜(日本Olympus公司)，Image Pro Plus 6.0图像分析软件(Media Cybernetics公司)。

1.2 动物模型的建立及分组 SD大鼠45只(由中国医大动物室提供)，随机分为3组:假手术组(Sham组)、rhEPO治疗组、MI组。方法参考马骥等〔7〕大鼠经水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉后仰卧固定于手术台板上，行颈部切开气管并插管，用动物人工呼吸机进行人工呼吸，于第4肋间开胸，剪开心包，暴露心脏、血管。在肺动脉圆锥和左心耳之间结扎左冠状动脉前降支，此时可见到左冠状动脉前降支供血区域变白，结扎成功标志为左心室前壁颜色变白和运动减弱。仔细检查心脏无出血时关胸。待动物出现吞咽动作后拔除气管插管。手术后腹腔内注射青霉素40万U以预防感染，并在30℃条件下苏醒。其中rhEPO治疗组结扎冠状动脉同时，术后每天腹腔注射rhEPO(1 000 U/kg);MI组结扎冠状动脉，并从术后每天腹腔注射等量的生理盐水，Sham组只开胸，不给予药物，术后给予等量生理盐水腹腔注射。

1.3 ELISA方法检测大鼠血清TNF－α含量 给药30 d后，处死大鼠，股动脉采血，采用酶联免疫试剂盒检测血清TNF－α含量，严格按照说明书完成。

1.4 RT－PCR方法检测 麻醉处死各组大鼠，冰上取出大鼠心脏，迅速冻存于－70℃冰箱备用。按RNAout说明书进行总mRNA提取，然后以逆转录(RT法)先合成cDNA，再进行PCR扩增;TNF－α 上游引物:5′－CGAGTGACAAGCCCGTAGCC－3′;下游引 物:5′－GGATGAACACGCCAGTCGCC－3′，扩 增 产 物 全 长255 bp。β－actin 的上游引物:5′－GAGACCTTCAACACCCAGCC3′;下游引物为:5′－GCGGGGCATCGGAACCGCTCA－3′，扩增产物全长374 bp。扩增产物进行1.5%琼脂糖电泳，UVP凝胶显像仪扫描并进行图像分析。用目的基因与β－actin光密度的比值代表目的基因的相对表达含量。

1.5 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行t检验。

2 结果

2.1 动物模型制作结果 术后3 d，MI组与rhEPO治疗组大鼠食欲低下，活动量明显减少，Sham组饮食行动正常。第30天，MI组大鼠死亡4只，rhEPO治疗组死亡1只，假手术对照组无死亡大鼠。

2.2 血清TNF－α表达含量变化 MI组的血清TNF－α表达为(46.95±18.69)pg/ml，与 Sham 组(19.42±6.25)pg/ml相比显著升高(P＜0.05);与 MI组相比，rhEPO治疗组(38.12±12.39)pg/ml的 TNF－α 表达显著降低(P＜0.05)。

2.3 RT－PCR结果 MI组大鼠心肌梗死区及周围组织的TNF－α mRNA 和 β－actin mRNA 的光密度比值为(0.51±0.25)，与Sham组(0.22±0.01)相比显著升高(P＜0.05);与 MI组相比，rhEPO治疗组大鼠MI区及周围组织的TNF－α mRNA和βactin mRNA的光密度比值(0.39±0.22)明显降低。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织TNF-α mRNA表达

3 讨论

MI后，将导致血供不足，最后造成有功能的心肌细胞减少以及心室重构，最终导致HF，而心肌细胞凋亡则是MI的重要特征之一〔8〕。EPO是一种含唾液酸的酸性糖蛋白激素，具有抗炎和免疫调节作用，在以往血液透析病人的EPO治疗中，发现长期应用 EPO 可使病人体内干扰素－γ(INF－γ)、TNF－α、白介素－6(IL－6)和白介素－8(IL－8)等致炎因子降低，而使抗炎因子白介素－10(IL－10)升高〔9〕，研究发现，促红细胞生成素通过上调抗凋亡蛋白Bcl－XL的表达而抑制促凋亡因子细胞色素C的释放，进而阻止Apaf－1降解物与细胞色素C结合所诱导的促凋亡蛋白酶Caspase－9的活化，从而起抗内皮细胞凋亡作用，保护血管内皮〔10〕，另有研究发现，EPO能够增加缺血处心肌细胞耐受缺氧的能力〔11〕，但是其具体的作用机制尚待进一步研究。

TNF－α在心室重塑中，能够刺激心室肌成纤维细胞和间质细胞增生，促进心肌胶原酶、蛋白酶的合成，使心室肌组织异常增生、肥大、纤维化导致心肌细胞坏死和HF，并调节胶原酶和C－jun基因的表达，NF－α能够诱导C－jun基因的持续激活，通过其与活化蛋白－1(AP－1)位点的结合导致MMPs基因激活，使心肌与其他细胞中的MMPs明胶分解活性增强〔12〕，有研究报道，β受体阻滞剂可通过减少心肌细胞TNF－α等细胞因子的表达而改善左室重塑和心功能〔13〕，但是，rhEPO能否通过调节TNF－α的表达改善心脏功能尚未见文献报道。

关于EPO保护缺血心肌的机制，目前争论较多，EPO心脏保护作用的机制尚不完全清楚。本实验结果提示，rhEPO能够很可能通过下调炎性因子TNF－α的表达来改善心脏功能，这个发现将为MI的药物治疗提供一定参考依据，

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R541.71

A

1005-9202(2015)09-2375-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.028

1 辽宁省人民医院金秋医院护理部

蔡长华(1958－)，男，主任医师，主要从事心功能不全患者的药物治疗研究。

邢 军(1976－)，男，硕士，主治医师，主要从事心血管疾病的介入治疗研究。

〔2014-03-13修回〕

(编辑 曹梦园)