慢性阻塞性肺病大鼠血红素加氧酶-1表达及其临床意义

徐 冰 张一兵 (辽宁医学院附属第三医院，辽宁 锦州 121000)

慢性阻塞性肺病大鼠血红素加氧酶-1表达及其临床意义

徐 冰 张一兵 (辽宁医学院附属第三医院，辽宁 锦州 121000)

目的 探讨血红素加氧酶(HO)-1在慢性阻塞性肺病(COPD)大鼠肺组织中的表达及其临床意义。方法 Wistar健康雄性大鼠60只随机分为模型组、药物干预组、生理盐水对照组各10只，分别给予烟熏配合脂多糖造模，烟熏配合脂多糖造模+大蒜素6.17 mg/kg灌胃，正常喂养等干预措施，5 w后进行肺功能测定，包括动脉血氧分压(PaO2)、二氧化碳分压(PaCO2)、氧合指数(PaO2/FiO2)。同时光镜下观察肺脏的形态，采用RT-PCR法检测各组HO-1 mRNA的表达。结果 与生理盐水对照组比较，模型组3 s用力呼气容积(FEV)3.0/用力肺活量(FVC)、呼气峰流速(PEF)、PaO2、PaO2/FiO2、HO-1 蛋白及基因表达下降显著(P＜0.01)，PaCO2升高显著(P＜0.01)。与模型组比较，药物干预组 FEV3.0/FVC、PEF、PaO2、PaO2/FiO2、HO-1蛋白及基因表达升高显著(P＜0.01)，PaCO2下降显著(P＜0.01)。各组光镜下肝脏显示:生理盐水对照组肺结构清晰，肺泡间毛细血管轻度扩张，部分支气管旁间质存在少许淋巴细胞浸润;模型组肺组织结构模糊，肺泡间毛细血管扩张明显并伴有出血，见大小不一凝固性肺坏死灶;药物干预组肺组织结构尚清，少量毛细血管扩张充血，肺泡腔内存在少许水肿液。结论 HO-1可能在COPD的发病过程中起保护作用，大蒜素改善COPD大鼠肺功能结构。

血红素加氧酶;慢性阻塞性肺病(COPD);大蒜素;mRNA表达

慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病机制的研究主要包括蛋白酶/抗蛋白酶失衡学说、炎症学说、氧化抗氧化失衡学说，关于蛋白酶/抗蛋白酶失衡学说和炎症学说已有较多研究。随着近期环境污染、雾霾及机体反应氧化物质的增多，氧化抗氧化失衡学说已受到重视。血红素加氧酶(HO)-1是一种最广泛存在的抗氧化防御酶，具有抗炎、抗氧化损伤、抗凋亡、抗增生的生理功能，可被多种刺激因素所诱导产生高水平的表达，如热休克、重金属、内毒素、血红素、细胞因子、紫外线等〔1，2〕。本研究通过动物实验从基因及蛋白两方面水平研究HO-1在COPD大鼠肺组织中的表达。

1 资料与方法

1.1 主要仪器 LEICA CM1850冰冻切片机(美国Beckman公司)，光学显微镜(日本OLYMPUS公司)，全自动生化分析仪(美国Beckman公司)，XD711酶标仪(美国Beckman公司)，小动物肺功能测定系统(美国Beckman公司)，PHYⅢ型病理组织漂烘处理仪(冷泉港生物科技股份有限公司)，电热自动恒温水温箱(上海医疗器械厂)等。

1.2 主要试剂 SP免疫组化试剂盒(PV-6001)购自北京中杉生物试剂公司;DAB增强性显色试剂盒(ZL19032)购自北京中杉生物试剂公司;HO-1酶联免疫试剂盒(hemin)和牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司;大鼠HO-1 ELISA试剂盒和 HO-1 ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。

1.3 COPD动物模型制备 健康Wistar健康雄性大鼠60只(由辽宁医学院动物中心提供)，SPF级别，体重(230±18)g。随机分为模型组20只，给予烟熏配合脂多糖(LPS，美国Sigma公司)处理〔3〕，第 1、15 天气管内滴入 LPS 200 μg，其余时间烟熏2次/d，每次60 min，共5 w;药物干预组20只，烟熏配合LPS造模后于第16天给予大蒜素，每天按体重6.17 mg/kg灌胃;生理盐水对照组20只，第1、15天气管内滴入无菌注射用水0.2 ml，其余时间正常条件下饲养。

1.4 肺功能测定 5 w后，测定3 s用力呼气容积占用力肺活量的比值(FEV3.0/FVC)和呼气峰流速(PEF)。末日熏吸香烟后用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，取仰卧位，测定动脉血氧分压(PaO2)、二氧化碳分压(PaCO2)、氧合指数(PaO2/FiO2)〔3〕。

1.5 光镜下观察肺脏的形态 组织取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→组织包埋→组织切片→展片附贴→切片脱蜡→染色→脱水→染片透明→封固→SP免疫组化→光镜下观察肺脏的形态，采用大鼠HO-1试剂盒用ELISA方法检测HO-1的蛋白表达。

1.6 RT-PCR法检测HO-1 mRNA的表达 取对数生长期细胞，以5×104个/ml接种于6孔板。培养12 h后，每孔加入1 ml Trizol提取总RNA，测RNA浓度，反转录获得cDNA。定量PC R 程序:起始95℃解链 5 min，扩增程序为 95℃15 s，60℃15 s，72℃50 s，共40个循环。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参基因，所使用的引物见表1。

表1RT-PCR所用引物

1.7 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件进行t检验。

2 结果

2.1 各组动脉血气分析结果 与生理盐水对照组比较，模型组 FEV3.0/FVC、PEF、PaO2、PaO2/FiO2下降显著(P＜0.01)，PaCO2升高显著(P＜0.01)。与模型组比较，药物干预组FEV3.0/FVC、PEF、PaO2，PaO2/FiO2升高显著 (P ＜0.01)，PaCO2下降显著(P＜0.01)，见表2。

表2 各组动脉血气分析结果(±s，n=20)

表2 各组动脉血气分析结果(±s，n=20)

与生理盐水对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01

组别 FEV3.0/FVC(%) PEF(ml/s) PaO2(mmHg) PaCO2(mmHg) PaO2/FiO2生理盐水对照组 75.6±12.0 42.8±7.6 90.2±12.0 38.6±8.2 432.1±20.3模型组 54.0±9.21) 24.6±4.41) 55.2±11.61) 61.4±5.51) 255.9±34.01)药物干预组 62.3±5.92) 29.5±8.22) 88.7±10.32) 40.0±6.72) 422.5±32.72)

2.2 肺组织光镜学检查 生理盐水对照组肺结构清晰，肺泡间毛细血管轻度扩张，部分支气管旁间质存在少许淋巴细胞浸润。模型组肺组织结构模糊，肺泡间毛细血管扩张明显并伴有出血，同时可见大小不一凝固性肺坏死灶的存在。药物干预组肺组织结构尚清，肺泡间隔内少量毛细血管扩张充血，肺泡腔内存在少许水肿液。见图1。

图1 各组肺组织光镜学检查(HE染色，×40)

2.3 各组肺组织HO-1蛋白和mRNA表达 与生理盐水对照组(5.06±0.05)比较，模型组 HO-1 蛋白表达(3.31±0.03)下降显著(P＜0.01)。与模型组比较，药物干预组HO-1蛋白表达(5.01±0.01)升高显著(P＜0.01)。各组 HO-1 mRNA 表达亦然，见图2。

图2 各组肺组织HO-1 mRNA表达

3 讨论

HO-1是一种存在于微粒体中氧化还原酶，是一种催化血红素降解为一氧化碳、铁和胆红素的起始酶及限速酶，生物学功能较为明显〔4〕，属于抗氧化防御酶，被认为是细胞应激的主要敏感指标之〔2，3〕。血红素降解过程是一系列自身催化的氧化反应过程。该过程需要NADPH-细胞色素P-450还原酶和分子氧的参与。它作用于血红素的α-亚甲基桥，在许多生理和病理过程中起到重要调节作用。

氧化/抗氧化失衡是COPD的主要发病机制之一〔5〕。近期报道显示，诱导HO-1的产生是机体氧化应激的标识，通过HO-1作用产生的胆色素比维生素E的抗氧化作用更强，因此推测HO-1所催化的反应是机体对氧化应激的一种反应，以此来达到对细胞的保护。吸烟者HO-1的诱导表达不足可能会增加患COPD的风险。Shinohara等〔6〕证实通过腺病毒基因转染的大鼠使HO-1表达增加，能够改善胰弹性蛋白酶导致的炎症反应、促炎症因子的生成和扩大气道，进一步表明HO-1在COPD发病中的作用。吸烟时烟雾能增加肺泡巨噬细胞HO-1的表达〔7，8〕。据 Matsumoto等〔9〕及 Li等〔10〕发现，HO-1 在 COPD 患者中的抗氧化调节作用可能发生的机制为:外源性的氧化剂导致机体氧化/抗氧化失衡，升高 HO-1水平。报道显示〔11〕，HO-1基因的多态性与肺气肿易感性息息相关。Shinohara等〔6〕发现，大鼠肺组织腺病毒介导的HO-1 cDNA转染降低弹力蛋白所致的肺气肿程度。Yamada等〔11〕证明HO-1基因的多态性与肺气肿易感性关系密切。本研究结果提示HO-1可能在COPD的发病过程中起保护作用，与上述研究结果较为一致。大蒜素是大蒜中提取得到的，有报道指出，作为天然的广谱抗生素，大蒜素能够利用捕获自由基来增加细胞内多种抗氧化酶的表达水平〔12〕。使用大蒜素作用肺泡上皮细胞6 h后，能升高细胞内的γ-谷氨酰半胱氨酸合酶(GCS)的表达水平〔13〕，提示大蒜素作用后细胞内的谷胱苷肽(GSH)含量增加可能与γ-GCS关系密切。本实验提示大蒜素可能通过HO-1来增加γ-GCS的表达来改善COPD。

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3 Cao J，Inoue K，Li XY.Physiological significance of hemeoxygenase in hypertension〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2009;41(5):1025-33.

4 Welsh MJ，Gaestel M.Small heat-shock protein family:function in health and disease〔J〕.NY Acad Sci，1998;85(8):128-35.

5 Di Filippo C，Marfella R，Cuzzocrea S，et al.Hyperglycemia in streptozotocin-induced diabetic rat increases infarct size associated with low levels of myocardial HO-l during ischemia/reperfusion〔J〕.Diabetes，2005;54(3):803-10.

6 Shinohara T，Kaneko T，Nagashima Y，et al.Adenovirus-mediated transfer and overexpression of heme oxygenase 1 cDNA in lung prevents bleomycin-induced pulmonary fibrosis via a Fas-Fas ligand-independent path-way〔J〕.Hum Gene Ther，2002;13(16):1945-60.

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8 Slebos DJ，Kerstjens HA，Rutgers SR，et al.Haem oxygenase-1 expression is diminished in alveolar macrophages of patients with COPD〔J〕.Eur Respir，2004;23(4):652-3.

9 Matsumoto H，Ishikawa K，Itabe H，et al.Carbon monoxide and bilirubin from home oxygenase-1 suppresses reactive oxygenspecies generation and plasminogen activator inhibitor-1 induction〔J〕.Mol Cell Biochem，2006;291(1-2):21-8.

10 Li MH，Jung JH，Na HK，et al.Carbon monoxide produced byhome oxygenase-1 in response to nitrosative stress induces expression of glutamate-cysteine ligase in PC12 cells via activation of phosphatidylinositol 3-kinasc and Nr12 signaling〔J〕J Biol Chem，2007;282(39):28577-86.

11 Yamada N，Yamaya M，Okinaga S，et al.Microsatcllitc polymorphism in the home oxygenase-1 gene promoter is associated with susceptibility to emphysema〔J〕.Am J Hum Genet，2000;66(1):187-95.

12 高崴崴，夏熙郑.HO-1与γ-GCS在COPD大鼠肺组织中的表达及大蒜素的治疗作用〔J〕.中国现代医药杂志，2011;13(1):22-4.

13 熊丽红，丁 亮，李 冰，等.大蒜素对大鼠肺泡上皮细胞γ谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的影响〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2006;29(6):368-71.

R541.61

A

1005-9202(2015)09-2353-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.019

辽宁省科技厅计划项目(No.2013225305)

张一兵(1961-)，男，硕士，教授，主任检验师，硕士生导师，主要从事临床内科疾病研究。

徐 冰(1974-)，女，在读硕士，主治医师，主要从事临床内科疾病研究。

〔2013-12-21修回〕

(编辑 苑云杰)