电针对继发性脊髓损伤后大鼠神经元自噬及相关蛋白轻链3Ⅱ和bcl－2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白3表达的影响

杨 波 隋汝波 (辽宁医学院附属第一医院神经内科，辽宁 锦州 121000)

电针对继发性脊髓损伤后大鼠神经元自噬及相关蛋白轻链3Ⅱ和bcl－2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白3表达的影响

杨 波 隋汝波 (辽宁医学院附属第一医院神经内科，辽宁 锦州 121000)

目的 观察电针治疗对大鼠继发性脊髓损伤(SCI)后神经元自噬及相关蛋白表达的影响。方法 健康SD大鼠随机分为对照组、模型组、西药组(甲泼尼龙治疗)及电针组(电针大椎、命门穴治疗)4组;除对照组外，其他3组均采用改良的Allen打击装置(50 g/cm)复制大鼠T10～11中度SCI模型。分别于SCI后6 h、1 d、7 d取损伤局部脊髓组织，经透射电子显微镜及Western印迹法，观察各组SCI后神经元自噬的病理变化及轻链(LC)3Ⅱ、bcl－2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白(BNIP)3的表达。结果 ①SCI后1 d脊髓组织中LC3Ⅱ、BNIP3表达明显升高(P＜0.01);电针组和西药组SCI后脊髓组织中LC3Ⅱ、BNIP3的表达显著降低，与模型组差异显著(P＜0.01);西药组与电针组差异不显著(P＞0.05)。②在透射电镜观察下，对照组脊髓组织神经元细胞核膜完整，胞质中线粒体形态分布及数目正常，未发现自噬小体，溶酶体数目也未见增多;模型组脊髓组织可见线粒体肿胀明显、空泡化，溶酶体数量增多，细胞核形不规则，可发现自噬小体;西药组和电针组可见脊髓组织神经元细胞肿胀，线粒体也略肿胀，核形规则，核内染色质欠均匀，溶酶体数目未见明显增多。结论 电针可降低SCI大鼠脊髓组织中LC3Ⅱ和BNIP3的表达，抑制细胞自噬，减缓脊髓损伤后的病理损害，其作用与甲泼尼龙相仿。

脊髓损伤;电针;自噬;轻链(LC)3Ⅱ;bcl－2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白(BNIP)3

脊髓损伤(SCI)大多源于交通事故、运动意外和暴力〔1，2〕。目前皮质类固醇激素类药物是唯一被美国联邦食品药品管理局批准治疗SCI的药物〔3〕，并取得了一定的临床疗效，但大剂量或长期使用会引起诸多不良反应〔4〕。近年来研究发现，电针可以阻止或减轻SCI后的继发性损害，促进脊髓的修复和再生〔5，6〕。继发性SCI的主要机制为凋亡和自噬。电针对SCI后脊髓细胞凋亡的研究已有众多的报道〔7，8〕，但是到目前尚无关于电针对SCI后脊髓细胞自噬影响的研究。本实验探讨电针干预对继发性SCI大鼠神经细胞自噬及自噬相关蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 分组及动物模型复制〔9〕选用成年SD大鼠40只，体重250～300 g，雌雄兼有。大鼠给予自由饮水和进食，白天和夜晚各12 h的睡眠、活动时间。随机分为4组，每组10只，为对照组、模型组、西药组(甲泼尼龙治疗)和电针组(电针大椎、命门穴治疗)。除对照组外，其他3组采用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔麻醉，俯卧位固定于自制的弓形手术台上，以微型咬骨钳咬除T9～11棘突和椎板，暴露脊髓，但不损伤硬脊膜。采用自制的Allen改良式打击装置，高度为5 cm，致伤量为50 g/cm，造成T10～11节段急性SCI(此致伤量可造成大鼠的不完全性截瘫，属中等程度损伤)。双下肢及背部肌肉瞬时收缩，硬脊膜下出血，鼠尾持续剧烈摆动数秒，麻醉醒后双下肢表现为不完全瘫痪，提示造模成功。

1.2 治疗模型制作 电针组是在造模大鼠苏醒后先行联合行为评分(CBS)，再选取大椎(第7颈椎棘突下，向下斜刺)、命门(第2腰椎棘突下，向上斜刺)进行针刺治疗，进针约0.5～0.7 cm。使用韩氏LH-202H型穴位神经刺激仪，大椎穴接阴极，命门穴接阳极，持续脉冲电流，频率2 Hz，治疗时间20 min，输出强度在刚开始时以背部肌肉出现轻微抽动为度，待其适应后则以双下肢瘫痪肌肉出现有节律的收缩为度。电针组每天同一时间重复治疗一次。西药组于造模后以30 mg/kg体重的甲泼尼龙尾静脉注射。第2天同一时间以5.4 mg/kg体重的甲泼尼龙尾静脉重复注射1次，之后再不给药。对照组和模型组不做任何治疗，但要在同一时间均抓取一次，以保证应激条件相同。

1.3 透射电镜观察 各组成模后7 d腹腔注射4%水合氯醛(4 ml/kg)麻醉后，自左心室灌注生理盐水，4%多聚甲醛-5%戊二醛灌注固定，损伤脊髓后角取约1 mm3的组织，磷酸缓冲液漂洗，1%饿酸后固定1 h，酒精、丙酮逐级脱水，环氧树脂618包埋，甲苯胺蓝染色后定位，超薄切片(60 nm)，醋酸铀、柠檬酸铅分别染色，透射电镜下观测。

1.4 Western印迹检测 麻醉方法同上，在不同时间点，迅速取出长约10 mm包括损伤区域的脊髓组织，组织蛋白提取试剂提取脊髓总蛋白，二辛可宁酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒定量蛋白浓度，相同质量的样品(40 μg)，4～12%NuPAGE凝胶恒压分离，湿转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封闭液室温封闭1 h，兔抗微管相关蛋白1轻链(LC)3多克隆抗体(1∶500)，兔抗基因bcl-2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白(BNIP)3多克隆抗体(1∶200)和小鼠抗β-actin单克隆抗体(1∶500)4℃孵育过夜，分别加入HRP标记山羊抗兔和HRP标记山羊抗小鼠的二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，化学发光液显影。Western印迹结果用扫描分析软件系统(Labworks Analysis Software，美国)测定各条带的积分灰度值，以目的蛋白与β-actin蛋白产物条带灰度值之比作为其蛋白水平的相对量。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计进行单因素方差分析、t检验。

2 结果

2.1 透射电镜观测神经元自噬 对照组脊髓组织神经元细胞核膜完整，胞质中线粒体形态正常(箭头所示)，未发现自噬小体，溶酶体数目也未见增多。模型组可见线粒体肿胀明显、空泡化，溶酶体数量增多，细胞核形不规则，可发现自噬小体。西药组和电针组可见脊髓组织神经元细胞肿胀，线粒体略肿胀，核形规则，核内染色质欠均匀，游离核糖体及溶酶体数目未见明显增多。见图1。

图1 各组7 d后神经元超微结构

2.2 Western印迹检测LC3Ⅱ的表达 LC3Ⅱ在对照组几乎不表达，在SCI后6 h，1、7 d 3个时间段，模型组脊髓组织中LC3Ⅱ表达均升高，与对照组差异显著(P＜0.01)，并且在损伤后1 d达到高峰;电针组与西药组均可降低LC3Ⅱ表达水平，与模型组差异显著(P＜0.01)。见图2、表1。

2.3 Western印迹检测BNIP3的表达 BNIP3在SCI后6 h明显升高，1 d后达到高峰(P＜0.01)，7 d后又下降至对照组水平，电针组与西药组均可降低LC3-Ⅱ表达水平，与模型组差异显著(P＜0.01)。见图2、表1。

图2 各组LC3Ⅱ、BNIP3表达Western印迹检测结果

表1 半定量分析不同损伤时间点LC3Ⅱ、BNIP3表达(n=10，±s)

表1 半定量分析不同损伤时间点LC3Ⅱ、BNIP3表达(n=10，±s)

与对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05

BNIP3组别 LC3Ⅱ6 h 1 d 7 d 6 h 1 d 7 d对照组 0.046 4±0.010 2 0.048 7±0.015 2 0.042 7±0.016 20.077 3±0.012 5 0.068 9±0.017 2 0.062 7±0.018 4模型组 0.146 6±0.026 41) 0.512 6±0.056 21) 0.365 5±0.023 21) 0.275 4±0.043 41) 0.441 7±0.065 81) 0.285 8±0.053 51)西药组 0.086 9±0.011 42) 0.079 8±0.009 22) 0.295 6±0.008 7 0.157 8±0.012 52) 0.179 7±0.009 52) 0.096 7±0.011 62)电针组 0.157 8±0.012 2 0.144 7±0.013 42) 0.123 7±0.009 62) 0.157 8±0.012 82) 0.144 7±0.013 62) 0.083 7±0.010 32)

3 讨论

SCI后的病理损害分为原发性SCI和继发性SCI〔10〕。前者是在受伤瞬间暴力直接或间接作用于脊髓所造成的伤害，属不可逆损伤;后者则是由前者引发的一系列神经病理变化(如脊髓缺血、缺氧、水肿及神经细胞变性坏死等)，采用治疗手段可影响它的发生和发展，属可控性损伤，所以目前研究的焦点主要是继发性 SCI〔11〕。

神经细胞自噬是继发性SCI的重要组成部分。很多研究也证实，继发性SCI广泛存在着神经细胞自噬现象〔11〕。自噬发生的过程是一系列自噬性结构逐渐演变的过程，自噬被诱导上调后，在细胞内形成隔离膜，并与需降解的胞质成分集结在一起，然后隔离膜延伸并包裹封闭胞质成分形成一个双层膜的结构，即自噬小体，自噬小体与溶酶体直接融合形成自噬溶酶体，最终在溶酶体酶的作用下被降解利用〔12〕。透射电镜是观察自噬现象的最直接、最经典的方法，而电镜检测自噬主要目的是辨认自噬小体的结构〔13〕。

Kanno等〔13〕也在SCI后3 d时使用透射电镜观测到了自噬小体，这与本实验结果基本一致，但Kanno等〔13〕的电镜图片没有区分损伤细胞的类型以及基本结构，而本文图片重点观察了细胞的超微结构。本文结果表明，电针组和西药组的镜下病变明显轻于模型组，并且恢复较好，两组均可减轻SCI后脊髓组织神经细胞的自噬。

自噬过程由一系列自噬相关蛋白介导完成。LC3是自噬体膜上的标记蛋白，当未发生自噬时，细胞内合成的LC3经过加工，成为胞质可溶性的LC3Ⅰ，常规表达;当自噬启动时，LC3Ⅰ经泛素样加工修饰，与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺结合，形成LC3Ⅱ〔13，14〕。LC3Ⅱ与 BNIP3二聚体上的 LC3结合区域结合参与诱导自噬〔14〕。

Kanno等〔13〕通过免疫荧光观测发现SCI后脊髓组织LC3Ⅱ和BNIP3的表达也升高，这与本研究的检测结果相符。正常的神经细胞中不能检测到 BNIP3，但是SCI后神经细胞缺血、缺氧时诱发自噬，导致BNIP3表达增高，本实验中也证实了SCI后BNIP3表达增高。另外，本结果另一个有意义的发现是电针治疗可以显著降低SCI后神经细胞LC3Ⅱ和BNIP3的表达，其作用和西药组相当。因此，电针可以通过调节不同时间段的LC3Ⅱ和BNIP3表达而阻断自噬信号的传导，抑制自噬，从而对神经细胞保护起到重要作用。

综上，电针治疗可以降低大鼠SCI后脊髓组织中LC3Ⅱ和BNIP3的表达，抑制神经细胞自噬，减缓SCI后病理损害。

1 Mc Donough PW，Davis R，Tribus C，et al.The management of acute thoracolumbar burst fractures with anterior corpectomy and Z-Plate fixation〔J〕.Spine，2004;29(17):1901-8.

2 Fehlings MG，Sekhon LH，Tator C.The role and timing of decompression in acute spinal cord injury:what do we know?what should we do〔J〕?Spine，2001;26(24Suppl):S101-10.

3 邓凤君，杨迎暴，徐江平.脊髓损伤治疗药物的研究进展〔J〕.中国药理学通报，2009;25(2):147-50.

4 Kubeck JP，Merola A，Mathur S，et al.End organ effects of highdose human equivalent methylprednisolone in a spinal cord injury rat mode〔lJ〕.Spine，2006;31(3):257-61.

5 李志刚，刘书坤.近十年电针治疗脊髓损伤的临床和实验研究概况〔J〕.中国中医药科技，2004;11(6):386-8.

6 宋 琳，李晓宁，王莹威.电针对急性脊髓损伤大鼠氧化应激反应的影响〔J〕.针灸临床杂志，2011;27(1):55-7.

7 时素华，李志刚，宋金玲，等.电针对大鼠脊髓损伤后caspase-3、calpastatin表达和髓鞘变化的影响〔J〕.广州中医药大学学报，2011;28(2):149-54.

8 时素华，李志刚，宋 萌，等.电针对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡受体及肿瘤坏死因子1表达的影响〔J〕.吉林中医药，2011;21(1):75-7.

9 苑晓晨，李志刚，宋金玲，等.不同时段电针对急性脊髓损伤大鼠作用机制的蛋白质组学分析〔J〕.针刺研究，2009;2(34):76.

10 Kwon BK，Tetzlaff W，Graue JN，et al.Pathophysiology and pharmacologic treatment of acute spinal cord injury〔J〕.Spine，2004;4(4):451-64.

11 Schmitt C，Nsranpttci GS，Dhodda VK，et al.Changes in spinal cord injury-induced gene expression in rat are strain-dependent〔J〕.Spine，2006;6(2):113-9.

12 Wang CW，Klionsky DJ.The molecular mechanism of autophagy〔J〕.Mol Med，2003;9(3-4):65-76.

13 Kanno H，Ozawa H，Sekiguchi A，et al.Induction of autophagy and autophagic cell death in damaged neural tissue after acute spinal cord injury in mice〔J〕.Spine，2011;36(22):E1427-34.

14 Hanna RA，Quinsay MN，Orogo AM，et al.Microtubule-associated protein 1 light chain 3(LC3)interacts with Bnip3 to selectively remove endoplasmic reticulum and mitochondria via autophagy〔J〕.J Biol Chem，2012;287(23):19094-104.

R683.2

A

1005-9202(2015)09-2339-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.014

辽宁省教育厅一般项目(No.L2012311)

杨 波(1975－)，男，硕士，副主任医师，主要从事神经系统疾病研究。

〔2013-12-21修回〕

(编辑 苑云杰)