电针通过mTOR/P70S6K信号途径增强胰岛素抵抗模型大鼠对胰岛素的敏感性

唐念珍 唐成林 黄思琴 杨 辉 张 毅 田 源 谢 辉 陈晓琳

(重庆医科大学中医药学院，重庆 400016)

电针通过mTOR/P70S6K信号途径增强胰岛素抵抗模型大鼠对胰岛素的敏感性

唐念珍 唐成林 黄思琴 杨 辉1张 毅 田 源 谢 辉 陈晓琳

(重庆医科大学中医药学院，重庆 400016)

目的 探讨电针对胰岛素抵抗模型大鼠胰岛素信号转导通路重要影响因子mTOR和P70S6KmRNA表达量的影响。方法 清洁级SD雄性大鼠70只，按随机数字表分为普食组(n=10)和模型组(n=60)，分别饲以普食和高脂高糖饮食。8 w后选取40只造模成功大鼠再一次随机分为高脂高糖饮食(HFHCD)1、HFHCD 2、电针(EA)1、EA 2组，每组10只;HFHCD 1组和EA 1组继续给予高脂高糖饮食，HFHCD 2组和EA 2组给予普通饮食。电针组针刺双侧“足三里”、“三阴交”、“胃脘下俞”，每次20 min，1次/d，针刺14 d。观察大鼠体重、血糖、胰岛素的变化，实时荧光定量PCR检测各组大鼠mTOR和P70S6KmRNA的表达量。结果 HFHCD 1组比CD组mTOR、P70S6KmRNA明显升高，HFHCD 2组比HFHCD 1组明显降低，EA1组较HFHCD1组明显降低，EA2组较HFHCD2组明显降低，EA2组较EA1组明显降低。结论 电针刺激胰岛素抵抗大鼠“足三里”、“三阴交”、“胃脘下俞”能降低mTOR和P70S6KmRNA的表达水平，恢复胰岛素信号通路的正常传导，增强胰岛素的敏感性，从而维持血糖的正常水平。

电针;胰岛素抵抗;雷帕霉素靶蛋白;核糖体蛋白S6激酶

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是胰岛素信号转导主要通路(PI3K/Akt信号通路)的重要下游效应蛋白，也是一种营养素水平变化的感受器，可感受能源物质水平的变化和细胞外营养成分的含量等信号，并通过激活核糖体蛋白 S6激酶(P70S6K)等下游因子而调节细胞生长、分化、生存和蛋白的合成等代谢过程〔1，2〕。P70S6K是介导胰岛素抵抗(IR)关键因子，可增加胰岛素受体底物(IRS)丝氨酸的磷酸化，从而导致酪氨酸磷酸化减少，进而抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信号途径传导，而引起IR〔3〕。目前研究针刺治疗IR的机制多是研究IRS-1、IRS-2、PI3-K等胰岛素信号通路的上游影响因子，而

S6K对其下游通路上的mTOR和P70S6K影响的研究较少。本研究通过观察电针对IR大鼠mTOR和P70S6KmRNA表达量的影响，探讨电针改善IR的机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康清洁级SD大鼠70只，雄性，4周龄，体重80～100 g，重庆医科大学实验动物中心提供〔实验动物许可证号:SCXK(渝)2012-0002〕。

1.2 主要试剂及仪器 葡萄糖测定试剂盒购于中国上海荣盛生物药业公司;大鼠胰岛素ELISA试剂盒购于美国R＆D公司;总RNA提取试剂购于天根生化科技有限公司;逆转录试剂盒购于日本Takara公司;荧光PCR试剂盒购于日本Takara公司;mTOR、P70S6K引物由Invitrogen Biotechnology中国公司合成。

AU2700全自动生化分析仪、实时荧光定量PCR仪(MX3005P)，重庆医科大学生命科学院提供;华佗牌针灸针(0.25 mm×13 mm)、SDZ-Ⅱ型电针治疗仪，中国苏州医疗用品厂有限公司。

1.3 造模及分组 SD大鼠25℃恒温、湿度50%左右，明暗周期12 h，适应性喂养1 w之后，随机抓取10只大鼠给予普通饲料，为普食组(CD)，其余60只均给予高脂高糖饲料，为模型组。饲料配方〔4〕:基础饲料60%+猪油15%+蔗糖25%(基础饲料和猪油均由重庆医科大学实验动物中心提供)。从第5周开始，每周清晨从大鼠眼眶静脉窦采血1次，检测其空腹血糖(FPG)、血清胰岛素(INS)，计算ISI〔ISI=1/(空腹血糖×空腹胰岛素)〕，因其为偏态分布，故取其自然对数做比较。各组大鼠每周同一时间称重一次。8 w之后，以FPG、INS均较CD组显著升高(P＜0.01)、ISI显著下降(P＜0.01)为IR模型制造成功的标准，最终得到IR大鼠44只。从中随机选出40只分为高脂高糖1组(HFHCD 1)，高脂高糖2组(HFHCD 2)，电针1组(EA 1)，电针2组(EA 2)，每组10只。CD组、HFHCD 2组、EA 2组给予普食喂养，HFHCD 1组、EA 1组给予高脂高糖饮食喂养。

1.4 针刺方法 每天早上9∶00将各组大鼠固定于实验台上，选取双侧足三里、三阴交、胃脘下俞进行针刺治疗，足三里、三阴交斜刺5 mm，胃脘下俞斜刺3 mm，同侧足三里和胃脘下俞接通电针仪，1次/d，每次20 min，连续针刺14 d。电针参数参照本课题组前期研究结果〔5〕:疏密波，频率 20 Hz，3 mA。CD组、HFHCD 1组和HFHCD 2组不进行针刺，但仍进行捆绑固定，以排除大鼠应激等因素导致的实验偏倚。

1.5 检测指标 (1)每周三上午由专人测量各组大鼠的体质量，观察各组大鼠进食量、饮水量、精神及活动情况。(2)采用葡萄糖氧化酶法检测FPG含量。(3)采用酶联免疫吸附法检测INS含量。严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 mTOR和P70S6KmRNA表达水平的检测 采用实时荧光定量PCR检测mTOR和P70S6KmRNA表达水平。取大鼠股四头肌100 mg用液氮研磨至粉末，装入无菌EP管内，用Trizol法提取总RNA，紫外分光光度计测总RNA浓度、纯度及完整性，确保A260/280比值在1.8～2.0之间。逆转录严格按照Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行操作，反应条件:42℃保温30 min，80℃5 min灭活反转录酶，－20℃保存反转录产物。目的基因及内参基因序列通过检索基因库获得，用Primer5设计引物。引物序列:mTOR 正义:5’-AGCACAAGGAGATCCGCATGGAAG-3’，反义:5’-CACCACCTGCACTGCAGTCTGG-3’，产物 176 bp;P70S6K 正义:5’-CCCACTGCTTTGAGCTACT-3’，反 义:5’-CTGAGGCACTCCAGGATG-3’，产物 265 bp;GAPDH 正义:5’-AATGGATTTGGACGCATTGGT-3’，反义:5’-TTTGCACTGGTACGTGTTGAT-3’，产物159 bp。实时荧光定量 PCR反应严格按照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书进行操作，反应条件:95℃预变性1 min;95℃→15 s，58℃→20 s，72℃→20 s;72℃延伸5 min;溶解曲线72℃ ～95℃，每20 s升温一次1℃。采用△△CT法计算结果。

1.7 统计学方法 应用SPSS19.0软件，计量资料用±s表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，多组之间均数的两两比较采用Duncan多重检验。

2 结果

2.1 电针对IR大鼠体质量的影响 高脂高糖饲料喂养8 w后，CD组与HFHCD组大鼠体重差异明显(P＜0.01)，说明体重增加与否和IR的发生并无必然联系。针刺14 d后，HFHCD 1组大鼠体重变化不明显(P＞0.05)，而HFHCD 2组大鼠体重变化显著(P＜0.01)，说明单纯饮食控制对IR大鼠体重的减轻有较显著的作用;EA组比HFHCD组大鼠体重减轻明显(P＜0.01)，见表1。

表1 电针治疗前后各组大鼠体重比较(±s，n=10，g)

表1 电针治疗前后各组大鼠体重比较(±s，n=10，g)

与CD组比较:1)P＜0.01;与HFHCD1组比较:2)P＜0.01;与HFHCD2组比较:3)P＜0.05;与EA1组比较:4)P＜0.01

组别 治疗前 治疗后CD组HFHCD 1组HFHCD 2组EA 1组EA 2组357.22±10.22 278.19±11.851)278.75±8.581)273.75±8.121)275.49±9.491)372.62±15.08 276.16±10.731)240.29±15.381)2)214.66±11.201)2)201.77±8.981)3)4)

2.2 电针对 IR大鼠 FPG、INS、ISI的影响 HFHCD组大鼠FPG、INS均较CD组显著升高，而ISI显著降低(P＜0.01)，EA组大鼠FPG、INS均较HFHCD组显著降低，ISI显著升高(P＜0.01)，HFHCD 2组与HFHCD 1组比较FPG差异无统计学意义(P＞0.05)，HFHCD 2组较HFHCD 1组INS显著降低，ISI显著升高(P＜0.01)，EA 2组较EA 1组FPG、INS显著降低，ISI显著升高(P＜0.01)，见表2。

表2 电针对IR大鼠FPG、INS、ISI的影响(±s，n=10)

表2 电针对IR大鼠FPG、INS、ISI的影响(±s，n=10)

组别 FPG(mmol/L) INS(mU/L)ISI CD组HFHCD 1组HFHCD 2组EA 1组EA 2组4.56±0.49 7.32±0.451)6.95±0.591)5.74±0.231)2)5.00±0.091)3)20.78±1.68 31.78±1.091)30.01±0.731)2)26.05±0.761)2)22.77±1.021)3)4)－1.97±0.56－2.37±0.031)－2.32±0.041)2)－2.17±0.021)2)－2.06±0.021)3)4)

2.3 电针对IR大鼠mTOR和P70S6KmRNA表达量的影响HFHCD1组 mTOR(3.316 6±0.271 1)和 P70S6KmRNA(2.204 9±0.249 8)表达量明显高于CD组(设为1);HFHCD 2组mTOR(2.446 9±0.346 1)和 P70S6KmRNA(1.806 5±0.118 2)表达量较HFHCD 1组显著降低(P＜0.01)，说明单纯饮食控制对抑制mTOR和P70S6KmRNA的表达有较显著的作用;EA 2组较 EA 1组，mTOR(0.831 2±0.240 1 vs 1.758 9±0.279 4)和 P70S6KmRNA(0.753 7±0.129 8 vs 1.479 3±0.189 0)表达量显著降低(P＜0.01)，提示饮食控制与电针治疗结合可更好地改善大鼠IR。EA组mTOR和P70S6KmRNA表达量明显低于HFHCD组，尤其是EA 2组mTOR mRNA表达量与CD组比较无明显差异(P＞0.05)，提示电针在抑制mTOR和P70S6KmRNA的表达方面有十分显著的作用。

3 讨论

胰岛素发挥其正常的生理作用主要依赖于其与细胞膜上的胰岛素受体结合后的信号传导过程的完整性，此过程中任何一个节点发生磷酸化或去磷酸化障碍，都有可能导致IR。胰岛素与其受体结合形成复合物后，其受体内的酪氨酸被磷酸化而激活，从而激活胰岛素受体底物(IRS)，进而激活另一信号因子PI3K，活化的PI3K可使其下游靶蛋白 Akt磷酸化，Akt再使mTOR被磷酸化而激活。

在正常状态下，mTOR/P70S6K在此通路上主要调节细胞生长和蛋白合成。当细胞外营养过剩时，mTOR作为一种营养成分感受因子，在高浓度葡萄糖的长期刺激下，会使 mTOR/P70S6K长期处于激活状态而过度表达，进而使IRS-1的丝/苏氨酸过度磷酸化，阻碍了其酪氨酸的磷酸化，抑制了胰岛素信号的正常传导，使PI3K/Akt通路失活，最终导致IR〔6〕，从而致使高血糖症、高胰岛素血症等。mTOR/P70S6K途径的激活还可导致过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子α(PGC-1α)活性下降，从而导致营养物质氧化代谢功能下降和线粒体功能紊乱，进而引起 IR 和肥胖〔7〕。本课题组前期研究〔8～10〕已证实，电针可抑制肥胖大鼠体内过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-γ等的表达，减少脂肪细胞的数量;还可降低C反应蛋白(CRP)、白介素(IL)-6、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α等的表达，降低肥胖大鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、FPG等的浓度，从而改善肥胖大鼠机体的炎症反应状态〔5，9～11〕;还可增强 IR大鼠体内葡萄糖转运子(GLUT)4的表达，抑制糖原合酶激酶(GSK)-3β的表达，从而加强葡萄糖的摄取、利用和转运。

祖国医学认为，IR的产生与脾、肾、肝有关〔11〕，多因先天禀赋不足，后天饮食失节，劳倦内伤，五志过极等导致脾胃受损，肾精亏虚，肝失疏泄，从而形成痰浊、瘀血、毒邪等病理产物〔12〕。足三里为足阳明胃经腧穴，三阴交为足太阴脾经腧穴，脾胃为气机升降之枢纽，共同调节全身气机。同时，三阴交也是足三阴经的交会穴，可调节足三阴经之经气。胃脘下俞为经外奇穴，位于足太阳膀胱经背部第一侧线上，其下有T8神经分布，主要支配胰腺传入神经。

本实验结果证实，体重增加与否和IR的发生并无必然联系;而电针治疗和(或)饮食控制能明显减轻大鼠体重。IR大鼠体内INS明显升高，但FPG并没有显著降低而是升高了，说明机体对胰岛素的敏感性降低十分明显，而电针治疗和(或)饮食控制对其有十分明显的改善作用，尤其是二者配合使用疗效更佳。大鼠发生IR后，体内mTOR和P70S6KmRNA表达量明显升高，使IRS-1丝/苏氨酸过度磷酸化，从而抑制了其酪氨酸的磷酸化，使胰岛素信号传导通路的传导受到抑制。而电针治疗可恢复胰岛素信号的正常传导，使血糖浓度下降、胰岛素敏感性得以恢复。

综上所述，电针增强IR模型大鼠胰岛素的敏感性可能是通过减弱mTOR和P70S6KmRNA的表达，从而减少胰岛素受体底物的丝/苏氨酸的磷酸化，增加其酪氨酸的磷酸化，恢复胰岛素信号通路的正常传导，增强胰岛素的敏感性，进而维持血糖的正常水平。

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Electroacupuncture enhances insulin sensitivity of insulin resistance rats through mTOR/P70S6Ksignal pathway

TANG Nian-Zhen，TANG Cheng-Lin，HUANG Si-Qin，et al.
Chinese Medical College，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture strengthening mechanism of insulin sensitivity on the content of mTORmRNA and P70S6KmRNAin insulin resistance rat.MethodsSeventy SD rats were randomly divided into common diet(n=10)and high-fat and high-carbohydrate diet groups(n=60).Forty rats of insulin resistance in high-fat and high-carbohydrate diet group were chosen and divided into HFHCD 1，HFHCD 2，EA 1 and EA 2 groups(n=10).Electroacupuncture was applied to two-side of ST36，SP6 and EX-B3 for 20 min once daily for 14 days.The changes of body weight，blood glucose and insulin were detected.The expressions of mTOR mRNA and P70S6KmRNA in insulin resis-tance rat skeletal muscle were determined by real time fluorescence quantitative PCR.ResultsThe expressions of mTOR and P70S6KmRNA were significantly higher in HFHCD 1 group than those of CD group，they were significantly lower in HFHCD 2 group than those of HFHCD 1 group，they were significantly lower in EA1 group than those of HFHCD1 group，they were significantly lower in EA2 group than those of HFHCD2 group，they were significantly lower in EA2 group than those of EA1 group.ConclusionsEA on ST36，SP6 and EX-B3 has a beneficial regulatory effect on the expressions of mTOR and P70S6KmRNA，and restore the normal conduction of insulin singnaling pathway，and enhance insulin sensitivity，and maintain the level of blood glucose in normal.

Electroacupunctrue;Insulin resistance;mTOR;P70

R245.9+7

A

1005-9202(2015)09-2333-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.012

国家自然科学基金(81273870)

1 重庆医科大学第一临床学院

唐成林(1966-)，男，教授，主要从事针灸推拿的研究。

唐念珍(1989-)，女，在读硕士，主要从事针灸推拿的研究。

〔2014-05-15修回〕

(编辑 袁左鸣)