植物线虫分子鉴定研究进展

卓 侃, 廖金铃,2*

(1.华南农业大学植物线虫研究室,广州 510642;2.广东生态工程职业学院,广州 510520)

植物线虫分子鉴定研究进展

卓 侃1, 廖金铃1,2*

(1.华南农业大学植物线虫研究室,广州 510642;2.广东生态工程职业学院,广州 510520)

植物线虫可危害农作物和林木,对它们的准确鉴定是防治植物线虫病害的基础。由于植物线虫很小,而且在形态上种间常有覆盖,而种内有较大的变异,仅依据形态特征很难鉴定。分子鉴定技术给植物线虫的检测和鉴定提供了快速、精确、可靠的方法。文章综述了植物线虫分子的DNA提取、分子鉴定靶标序列的选择及分子鉴定方法等方面的研究进展及现状,以促进对植物线虫分子鉴定更深入的研究。

植物线虫; 分子鉴定; DNA; PCR

线虫动物门是动物界中最大的门之一,线虫数量庞大,种类繁多,生活方式多样。其中,有许多种类是寄生植物的,这些线虫称为植物线虫。目前,正式报道了约4 100种植物线虫[1],它们已成为危害农林生产和食品安全的一个重要因素[2]。据估计,每年因植物线虫的危害可导致800亿美元的损失[3],因此植物线虫的防治已成为生产上的一项重要工作。抗线虫植物品种的选择和作物轮作的方法是防治植物线虫的重要手段,这些方法的应用是建立在植物线虫准确鉴定的基础上。另外,由于不同线虫对杀线虫剂敏感性可能不同,或某些线虫对某些药剂会产生抗药性,所以在使用化学防治前,最好也要了解清楚植物线虫的种类。人们一般是依据形态对植物线虫进行鉴定。然而,植物线虫非常小,体长一般在0.3～2 mm[4],而且通常植物线虫种间形态有覆盖,而种内却有较大的变异,这给人们鉴定带来很大的困难。近年来,随着一些线虫分类学家的退休,同时年轻的科研工作者对线虫形态分类的兴趣逐渐减弱,专业从事线虫形态分类鉴定的科研工作者越来越少[5]。因此,迫切要求一些新的线虫鉴定技术的发明和使用。

同工酶电泳技术是鉴定植物线虫的方法之一。通常,种内的酶谱带一致,而种间则有不同,通过分析谱带类型即可进行种的判定。该技术最早在20世纪70年代初应用于几种常见根结线虫(Meloidogyne sp p.)的鉴定[6]。虽然该技术在其他一些线虫,如大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)、三形茎线虫(Ditylenchus triformis)和燕麦真滑刃线虫(Aphelenchus avenae)上也有过研究[6],但目前同工酶谱分析只有在根结线虫中得到较好的应用。究其原因,主要是由于某些蛋白只能在线虫特定的阶段才会表达,因此同工酶的提取对虫态有严格的要求,一般只能选用年轻的雌虫。除了根结线虫,其他植物线虫的年轻雌虫相对较难获得。然而,线虫的DNA通常不会随着线虫虫态或环境的变化而出现变化,随着分子生物学技术的发展,基于DNA的线虫鉴定技术得到迅速发展。本文综合国内外大量文献并结合本实验室的研究结果对植物线虫分子鉴定技术的进展和研究近况进行概括和综述,以期为我国植物线虫分子鉴定技术研究提供参考信息。

1 DNA的提取

分子鉴定的第一步是线虫模板DNA的准备。植物线虫DNA的提取方法目前已经比较成熟。早期通常对大量的活体线虫进行DNA提取,采用的方法一般是常规的酚氯仿抽提法[7]。然而,由于大多数植物线虫难以进行大量纯化培养,且从自然界中分离到的线虫经常为混合种群,因此少量线虫,特别是单条线虫的DNA提取越来越受到人们的重视。通常通过虫体的裂解、蛋白酶K处理及短暂的高温处理等步骤即可获得可进一步用于PCR的单条线虫DNA[8- 12]。

上述线虫的DNA提取首先要将线虫从土壤或病组织中分离出来,需要花费一定的时间。为了加快线虫的检测速度,近年人们研究了直接从含线虫的土壤或病组织中提取DNA,只要该模板中含有少量靶标线虫的DNA,就可以通过进一步的PCR将靶标线虫检测出来。该方法最大的限制因素是从土壤或植物组织中抽提的DNA中会存在多种抑制因子,如腐殖酸、酚类化合物、蛋白和多糖等[1314],这些抑制因子可能会影响下一步的PCR。然而,目前随着DNA提取方法和试剂的不断改进,这些抑制因子的影响已基本可以被克服,越来越多的成功例子被报道。例如：Atkins等[15]利用土壤DNA提取试剂盒直接提取含假根结线虫(Nacobbus)的土壤总DNA,并利用PCR方法成功地从该模板中检测到假根结线虫;Yan等[16]提取含落选短体线虫(Pratylenchus neglectus)和桑尼短体线虫(P.thornei)的土壤DNA,并用PVP柱纯化该DNA,最后成功地检测到这两种短体线虫;Min等[17]用实时荧光定量PCR方法从含南方根结线虫(M.incognita)的沙壤土DNA中检测到南方根结线虫;Sayed Abdul Rahman等[14]提取了含根结线虫的香蕉根DNA,并用PCR方法从中检测到根结线虫;Hu等[18]提取了单个根结的DNA,并利用多重PCR的方法从单个根结DNA中成功地鉴定了南方根结线虫、象耳豆根结线虫(M.enterolobii)和爪哇根结线虫(M.javanica);Peng等[19]提取了被相似穿孔线虫(Radopholus similis)侵染的香蕉、红掌和柑橘的根DNA,并利用环介导等温扩增(LAMP)技术从这些DNA中成功检测到相似穿孔线虫。

植物线虫的DNA除了可以从活体线虫中提取,也可以从一些固定的标本中提取。一些研究表明可以从保存在福尔马林或甘油中几天甚至几年的线虫标本中提取DNA[20-23]。Rubtsova等[23]甚至报道从固定超过10年的长针线虫(Longidorus sp.)中提取出DNA,并以此DNA为模板,准确地扩增了28S r RNA的D2区序列。从固定的线虫标本中提取DNA,对人们分析一些稀有种类具有较大的帮助。

2 DNA靶标序列的选择

理想的用于鉴定物种的DNA靶标序列通常是在种内保守,而在种间变异大,并容易被扩增。在植物线虫中,核糖体DNA(r DNA)是最常用来做鉴定的靶标序列,r DNA是线虫中最早被鉴定的序列之一,且该区段是多拷贝序列,容易扩增。其中,核糖体DNA内转录间隔区(ITS)是使用最多的区段[24-26]。ITS可以很好地用于一些植物线虫属下种的区分和鉴定,比如伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus)、孢囊线虫属(Heterodera)、茎线虫属(Ditylenchus)、半穿刺线虫属(Tylenchulus)和隐皮线虫属(Cryphodera)等[27-31]。然而,ITS序列也不是在所有植物线虫属中均可用来区分种。在根结线虫属中,几个常见的种如南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫(M.arenaria),它们彼此之间的ITS序列非常保守[7,24,32],根本无法用ITS序列来区分。而在短体线虫属中,ITS序列在一些种内变异很大[33-35],例如玉米短体线虫(P.zeae)和落选短体线虫种内变异分别达到8%和6%,明显高于短体线虫咖啡物种复合体的种间差异,因此单用ITS序列来鉴定短体线虫有时可能会出错。除了ITS,r DNA中的18S r RNA基因和28S r RNA基因中的D2D3区也在植物线虫的分类鉴定中有较广范的使用。相对于ITS,18S r RNA和28S r RNA更为保守,因此它们在区分属或属上分类阶元时可能更为好用。当然,在某些垫刃类线虫或长针类线虫中,D2D3也可以用来区分种[36-37]。另外,r DNA中的间隔基因区(IGS)也在少数植物线虫种的鉴定中被使用,如Petersen和Vrain[38]依靠IGS序列鉴定了3个在欧洲重要的根结线虫种。

线粒体DNA(mt DNA)是许多动物分类鉴定的重要靶标,尤其是mtDNA的CO I基因。mtDNA作为植物线虫鉴定的分子靶标的研究相对起步较晚,也较少。目前,COⅡ/rrn L之间的序列在一些根结线虫种的鉴定方面起到重要的作用[11,3941]。此外, CO I基因也被用来分析伞滑刃线虫属松材组和剑线虫属(Xiphinema)美洲组线虫的系统发育[4243]。

除了r DNA和mt DNA,其他一些看家基因甚至效应蛋白基因也被尝试用来鉴定植物线虫。例如：主要精子蛋白基因(major sperm protein,msp)被用来区分穿刺短体线虫(P.penetrans)和斯克里布纳短体线虫(P.scribneri)[44];热激蛋白90基因(Hsp 90)被用来区分和研究一些根结线虫、孢囊线虫和短体线虫的系统关系[45];肌动蛋白基因(actin)被用来区分孢囊线虫属、球孢囊线虫属(Globodera)和根结线虫属[46];一个分支酸变位酶(chorismate mutase)基因被用来区分几个球孢囊线虫[47];β-1,4-内切葡聚糖基因(β-1,4-endoglucanase gene)被用来鉴定桑尼短体线虫[48]。这些基因在植物线虫的鉴定中是否能发挥更重要的作用有待今后更多的研究验证。

3 分子鉴定技术与方法

植物线虫分子鉴定的技术方法不少,大多数是在PCR的基础上发展起来的。比如基于多态性分析的一些分子标记方法：包括限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性(RAPD)和扩增片段长度多态性(AFLP)。另外像PCR后测序比对、利用特异性引物扩增、qPCR等技术是近年来应用较多的技术。此外,还有一些具有发展潜力的方法,如DNA微阵列杂交技术。下面介绍几种在植物线虫鉴定中目前应用较多、比较重要的方法。

3.1 PCR-RFLP

RFLP技术是利用DNA的特定序列能被限制性内切酶识别并切割的特点,用限制性内切酶去切割不同物种的DNA,由于不同物种的核苷酸序列不同,酶切后会产生不同大小与数量的片段,再通过电泳进行判断。早期人们用限制性内切酶直接酶切植物线虫的总DNA,如Curran等[49]用Eco RⅠ对4种常见的根结线虫总DNA进行酶切。虽然不同种的DNA酶切片段会不同,但由于总DNA太大,酶切出来的片段一般也大,而且多,导致这些片段在电泳胶上密集出现而连成一片,很难辨别,往往需要进一步的Southern印迹杂交才有可能判断,因此不利于鉴定。鉴于此,后来人们先用通用引物去扩增不同物种的同一个分子区段,然后再用限制性内切酶去酶切该区段,就可以通过电泳获得清晰的RFLP图谱。通常同一物种RFLP图谱相同,而不同种则不同。在植物线虫中,较多的是先扩增ITS区,然后用5～6种限制性内切酶对ITS区进行酶切,获得各个种的ITS-RFLP图谱。现在超过50种的伞滑刃线虫属线虫和超过45种的孢囊线虫属线虫已建立了ITS-RFLP图谱[50-51],RFLP图谱已成为这些线虫鉴定的一个重要依据。在根结线虫中,RFLP方法可以很好地区分南方根结线虫和爪哇根结线虫。用引物对C2F3和1108先扩增COⅡ/rrn L之间的序列,两者均产生大约1.7 kb的序列,再用Hin f I进行酶切,南方根结线虫可以产生1.4 kb和0.3 kb两条带,而爪哇根结线虫则不能被酶切[39]。然而,越来越多的研究发现植物线虫r DNA-ITS和mt DNA存在异质性,即种内不同个体间甚至个体内部在相同区段存在DNA序列的变异,如果恰好在选用的酶切位点处发生变异,就会导致PCR-RFLP图谱产生种内差异[51-52]。例如,在孢囊线虫属中,至少已发现6种孢囊线虫存在ITS异质性而使某种酶的酶切谱带出现2种或2种以上的现象[28,51]。因此,使用RFLP技术鉴定植物线虫种需要注意序列异质性的问题。

3.2 测序比对

直接测序比对的方法是鉴定物种的一个有效方法。在植物线虫中,通常扩增r DNA的ITS或D2D3序列,或mt DNA的CO I或COⅡ等基因,然后进行测序,再在Gen Bank中进行BLAST比对。1993年,Ferris等[53]最早对孢囊线虫的ITS区进行了测序。目前,越来越多的植物线虫鉴定靶标序列被测定并储存在GenBank中,而且测序费用也在不断下降,因此直接测序比对的方法已在植物线虫鉴定中得到越来越广泛的应用,该方法必然是今后植物线虫鉴定的最重要手段之一。

3.3 基于物种特异性引物的PCR扩增

随着测序技术的飞速发展,获得了越来越多的植物线虫序列。通过序列的比对,人们可以设计出特异性引物来扩增靶标线虫的靶标序列,然后通过电泳比较扩增条带的有无及大小即可鉴定靶标线虫。当然,有一些特异性引物是从早期的多态性分析分子标记技术,如RAPD技术基础上发展来的,我们通常称之为序列特异性扩增区(sequence characterized amplified region,SCAR)标记。换言之, SCAR标记就是将目标RAPD片段进行克隆并对其末端测序,根据RAPD片段两端序列设计特异引物,对基因DNA片段再进行PCR特异扩增。一个好的SCAR标记可以快速检测大量个体,结果稳定性好,重现性高,比如Zijlstra和Donkers-Venne[54]在RAPD基础上设计的用来区分3种常见根结线虫(南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫)的SCAR标记(Finc/Rinc、Fjav/Rjav和Far/Rar)一直受到人们的青睐及使用。相对于测序比对,利用特异性引物的PCR扩增(或称特异性PCR扩增)方法更快速、简单、直观,因此得到广泛的应用。鉴定孢囊线虫、根结线虫和短体线虫的一些物种特异性引物可参考几本专著[28,5556]。

在特异性PCR扩增基础上发展起来的双重PCR(duplex PCR)或多重PCR(multiplex PCR)技术也是植物线虫鉴定的一种重要方法。双重PCR或多重PCR是利用两对或两对以上的引物在单个PCR反应中扩增出多个核苷酸片段,以达到同时检测多个物种的目的。多重PCR的概念是在1988年提出的[57],此后被广泛应用在物种的鉴定上。该技术也不断被用于植物线虫的检测和鉴定,比如对一些常见根结线虫种的鉴定,Hu等[18]用4对引物同时鉴定南方根结线虫、爪哇根结线虫和象耳豆根结线虫;Kiewnick等[58]同时使用3对引物鉴定3种常见的根结线虫——南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫。另外对松材线虫(B.x ylophilus)及其近似种的区分和鉴定,如Jiang等[59]用2对引物鉴定松材线虫;Zhuo等[60]用5条引物同时鉴定3种松材组线虫——松材线虫、拟松材线虫(B.mucronatus)和豆伞滑刃线虫(B.doui)。还有对短体线虫一些近似种的区分和鉴定,如Wang等[61]用2对引物区分甘蔗上的两个近似种——拟玉米短体线虫(P.parazeae)和玉米短体线虫(P.zeae)。多重PCR可以加快检测的速度,但如果在一个反应体系中存在一对以上的引物,那引物相互间可能会互相干扰,导致PCR反应体系不稳定,因此多重PCR反应体系通常需要花费较多的时间进行优化[62]。

3.4 实时荧光定量PCR检测

实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后还可通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与传统PCR相比,qPCR反应更快、更灵敏,可对整个PCR进程进行实时监测,另外不仅可定性,还可定量。因此,该技术从发明以来,在临床疾病诊断和植物病害诊断等领域得到快速发展。qPCR在植物线虫的检测中,通常有SYBR GreenⅠ法和Taq Man探针法。由于qPCR整个检测过程通常只需要0.5～2 h,因此其在检疫部门得到广泛的应用。国内外有大量的研究报道利用qPCR技术检测松材线虫[63-67]。另外,一些重要的植物病原线虫,如马铃薯白线虫(G.pallida)和甜菜孢囊线虫(H. schachtii)[68]、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)和南方根结线虫[69]等,也有用qPCR进行快速检测的报道。结合多重PCR技术,人们还发明了多重qPCR技术同时检测几种线虫,例如在一个qPCR体系中同时检测哥伦比亚根结线虫(M.chitwoodi)和伪根结线虫(M.fallax)[70]及同时检测3种球孢囊线虫——马铃薯金线虫、马铃薯白线虫和烟草球孢囊线虫(G.tabacum)[71]。

此外,我们还可利用qPCR测定土壤中的线虫密度。由于qPCR反应中切割的荧光分子数与PCR产物的数量成比例,因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量,从而计算出线虫的数量。近年来,该方法在土壤线虫的定量研究中越来越受到重视,如Yan等对土壤中落选短体线虫和桑尼短体线虫的定量[16,72];宋志强等对土壤中南方根结线虫的定量[73]。

3.5 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是于2000年发明的一种DNA扩增技术[74]。该技术能在60～65℃的等温条件下,短时间(一般不超过1 h)内进行核酸扩增;使用一对外部引物和一对内部引物,识别靶标序列上6个不同的区域,因此对靶标序列具有高度的特异性;扩增产物的检测方法多样,除了可电泳检测,也可在反应体系中加入染料,根据颜色的变化直接用肉眼观察,还可利用浊度仪检测扩增产物的混浊度。与传统PCR相比,LAMP不需要昂贵的PCR仪,也不需要跑电泳,因此具有简便、快速、精确、特异和低价的特点。该技术目前广泛应用于病原物的检测,在植物病原真菌和细菌的检测方面已有一些应用[7576]。在植物线虫学领域,近年来也有一些成功的例子,包括对松材线虫、根结线虫和相似穿孔线虫的检测[19,7779]。总的来看,LAMP技术是一个相对比较新且具有一定实用性的分子检测技术。目前LAMP技术在植物线虫领域应用还较少,值得今后进一步研究。

4 DNA条形码

DNA条形码(DNA barcoding)是一个相对较新的概念,是2003年Hebert提出来的,即利用一段短的标准DNA序列作为标记来实现快速、准确的物种鉴定,就像超市利用条形码扫描区分成千上万种不同的商品[80]。通常拿来作条形码的DNA片段需要满足几个条件：(1)在种间有足够的差异;(2)不要太长,以便扩增;(3)两端序列保守,容易设计通用引物[81]。mt DNA比r DNA进化更快,有足够的差异去区分近缘种,其中mtCO I基因大约为650 bp,较好地符合上述条件,因此常被当做动物鉴定的条形码[80,82-84]。在线虫中,已有研究发现mtCO I基因可以作为海洋自由生活线虫的DNA条形码[85],然而植物线虫的mtDNA研究还很少。在植物线虫中研究较多的几个r DNA片段,如ITS、D2D3和18S r RNA,有的在一些植物线虫属中变异太大,有的又太保守,Subbotin等[86]认为种内变异、旁系同源拷贝或无法区分最近形成的物种等因素部分限制了r DNA的使用。因此,不同的植物线虫类群也许需要不同的DNA条形码,或者需要多个基因片段作为条形码。总之,植物线虫的DNA条形码研究才刚起步,需要获得更多的序列以便更深入的研究。

5 问题与展望

植物线虫分子鉴定起步相对较晚,目前已经获得序列的植物线虫种类还较少,因此当前还不可能完全依赖分子手段来对植物线虫进行鉴定。此外,根据目前的研究,在植物线虫鉴定中常用的r DNAITS序列在某些线虫中变异大[33-35],而在某些线虫中又很保守[7,24,32],因此针对不同的线虫类群,需要在研究足够多序列的前提下,了解清楚序列的种内变异及种间变异的范围,才能更好地选择合适的鉴定靶标。当前,分子手段已经给植物线虫的检测和鉴定提供了快速、精确、可靠的方法。尤其对一些生产上重要种类的快速检测,以及区分一些形态上十分相似的近缘种,分子鉴定给我们带来了极大的帮助。近年在形态学基础上,结合分子手段鉴定了一些仅从形态上不好确定的新种,如与鳞球茎线虫(D.dipsaci)形态相似的巨大茎线虫(D.gigas)[29],与咖啡短体线虫(P.coffeae)形态基本难以区分的斯派吉尔短体线虫(P.speijeri)[87],与玉米短体线虫形态相近的拟玉米短体线虫[61]。随着分子生物学技术的不断发展及更多的植物线虫序列被测定,可能会有更简单、方便、可靠的分子鉴定方法被发明。不论是现在,还是将来,分子鉴定方法都是植物线虫鉴定的一个有力工具。

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(责任编辑：田 喆)

Advances in molecular identification of plant nematodes

Zhuo Kan1, Liao Jinling1,2

(1.Laboratory of Plant Nematology,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China; 2.Guangdong Vocational College of Ecological Engineering,Guangzhou 510520,China)

Plant nematodes can damage crops and trees.The accurate identification of plant nematodes is the basis for the control of plant nematode diseases.It is very challenging to identify plant nematode species only based on morphology,because plant nematodes are microscopic in size,and some morphological characters may have interspecific overlapping or intraspecific variability.Molecular techniques provide a fast,accurate and reliable method for the detection and identification of plant nematodes.For promoting the deep study on molecular identification of plant nematodes,this paper summarized research progresses in and current research status on DNA extraction of plant nematodes,target sequences for identifying plant nematodes and the main molecular identification methods for plant nematodes.

plant nematode; molecular identification; DNA; PCR

S 432.45

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.001

2014-10-06

2014-10-13

公益性行业(农业)科研专项(201103018)

*通信作者 E-mail：jlliao@scau.edu.cn