壳聚糖衍生物及其抑菌活性研究进展

胡林峰, 邢荣娥, 刘 松, 秦玉坤, 陈晓琳, 李鹏程*

(1.中国科学院海洋研究所, 青岛 266071; 2. 河南科技学院化学化工学院, 新乡 453003)



专论与综述

壳聚糖衍生物及其抑菌活性研究进展

胡林峰1,2, 邢荣娥1, 刘 松1, 秦玉坤1, 陈晓琳1, 李鹏程1*

(1.中国科学院海洋研究所, 青岛 266071; 2. 河南科技学院化学化工学院, 新乡 453003)

壳聚糖是迄今为止发现的唯一阳离子动物纤维和碱性多糖,其具有抑菌、抗肿瘤等多种独特的生物活性,对壳聚糖进行衍生化是改善其理化性质,提高其生物活性的有效方法。本文综述了不同壳聚糖衍生物,如烷基化壳聚糖、氨基壳聚糖、季铵盐壳聚糖、羧甲基壳聚糖,以及壳聚糖的酯、硫脲、氨基酸等化合物的制备,着重阐述了不同壳聚糖衍生物对细菌和真菌的抑菌活性;有助于指导新型壳聚糖抑菌活性物质的设计和合成,寻找高活性抑菌壳聚糖材料。目前,壳聚糖及其衍生物在抑菌活性领域的开发和应用,亟须开展壳聚糖衍生物结构与抑菌活性间的构效关系研究,探索高抑菌活性壳聚糖的作用机理。

壳聚糖; 壳聚糖衍生物; 抗菌活性; 抑菌机理

1 壳聚糖简介

壳聚糖(chitosan)又名聚氨基葡萄糖,由多个氨基葡萄糖单体通过β-1,4-糖苷键连接而成的聚合物,是甲壳素(chitin)部分或全部脱去乙酰基后得到的高分子直链多糖[1-3]。壳聚糖是迄今为止发现的唯一阳离子动物纤维和碱性多糖,其分子因脱乙酰程度的不同所带正电荷强度也不同。依据正电荷的数量及壳聚糖分子量,壳聚糖表现出不同的生物相容性和生物活性。壳聚糖分子链上丰富的羟基和氨基使其易于进行化学修饰而具有多种功能,表现出独特的生物活性,如抑菌、抗肿瘤等。壳聚糖及其衍生物已在农业、医药、食品和环境保护等领域得到广泛的应用[4-7]。

壳聚糖的抗菌活性受到很多内在因素以及外部环境因素的影响,如壳聚糖及微生物的种类、壳聚糖的聚合度、壳聚糖的脱乙酰度以及溶剂的酸碱度等。根据这些特性,人们做了大量的研究来提高壳聚糖的生物活性。研究者通过对壳聚糖进行结构改造,调节各分子因素,发现了很多具有更高抗菌活性的壳聚糖衍生物[8]。这些衍生物包括羧甲基壳聚糖、季铵盐型壳聚糖、烷基化壳聚糖,以及壳聚糖的氨基和硫脲等衍生物。

2 壳聚糖衍生物及其抑菌活性研究进展

2.1 烷基壳聚糖衍生物

壳聚糖的烷基化衍生物主要针对2-NH2进行烷基化修饰[9]。Yang等研究发现,经烷化修饰的壳聚糖水溶性有所改善,中性条件下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性显著高于壳聚糖[10-11]。此外,Tømmeraas等[12]通过N-烷基化作用,将三糖2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃型葡萄糖-β-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃型葡萄糖-β-(1→4)-2, 5-酐-甘露糖呋喃糖分子(A-A-M),接枝于低分子量且完全脱乙酰化的壳聚糖分子,发现40%支链化所得的壳聚糖衍生物可溶于任意pH条件的溶液。Li等[13]则分别以丁基溴、辛基溴修饰壳聚糖分子。烷基基团的引入使壳聚糖分子的氢键作用、结晶度都有所削弱。Britto等[14]为改善壳聚糖分子的机械性能及疏水性质,分别对2-N位置引入丁基、辛基、十二烷基支链。在相同的酸性介质中,烷基碳链越长,疏水性能越强;碱性介质中,由于烷基化壳聚糖体系存在一定程度的收缩效应,其成膜后的渗透系数和扩散系数随烷基碳链的增长而上升。

虽然多种烷基壳聚糖衍生物得到制备,但其抑菌活性未被测定。壳聚糖通过烷基化改造后,其水溶性及其他理化性质均有所变化,据此推测烷基化壳聚糖衍生物的抑菌作用会有所提高。

2.2 壳聚糖氨基衍生物

壳聚糖在酸性条件下氨基质子化而带正电,能与带负电的细菌细胞外膜通过静电相互作用结合而发挥抑菌功能。连接到壳聚糖骨架上的氨基的数量对壳聚糖的抑菌活性也有影响。接入的氨基基团可改变壳聚糖分子总体的pKa,使其在中性甚至碱性条件下更容易带正电荷,正电荷密度的增加可以增强分子与微生物的相互作用程度,增强其抗菌活性。因此很多研究者通过向壳聚糖分子中引入含氨基的基团来增强其生物活性,氨基的增加也可以提高壳聚糖衍生物的溶解性能。

Je和Kim等[15-16]利用2-氯乙氨盐酸盐与壳聚糖的羟基和氨基发生亲核取代,得到氨乙基壳聚糖衍生物,该化合物具有良好的水溶性和优异的抑菌活性(对Pseudomonasaeruginosa的最小抑菌浓度达到7.813 mg/L)。Satoh等[17]对壳聚糖2位氨基保护之后对6位羟基进行选择性取代,合成了6-氨基-6-脱氧壳聚糖,不过尚未见其抗菌活性的报道。Zhong等人将壳聚糖与磺胺类化合物反应制备出壳聚糖磺胺衍生物,该类化合物对早疫病菌(Alternariasolani)和茎枯病菌(Phomopsisasparagi)在50～500 mg/L的浓度下表现出显著的抑菌活性[18]。Meng等向壳聚糖氨基及羟基引入氨基并对其作季铵化处理,产物的水溶性及抑菌活性均有所提高,酸性条件下对大肠杆菌的最小抑制浓度为4 mg/L[19]。

除氨基小分子外,一些含氨基的聚合物也被用来对壳聚糖进行修饰。Klaykruayat等[20]合成了树枝状聚乙二胺聚合物并将它与壳聚糖的2-NH2通过酰胺键连接。与壳聚糖相比,所得到的化合物在中性条件下即显示了良好的水溶性和较强的抑菌活性。另外还有人利用高碘酸氧化断裂2、3位之间的C键产生醛基,再通过西弗碱对壳聚糖进行化学修饰,将聚乙二胺等与壳聚糖连接,所得化合物水溶性良好,但其抑菌活性尚未见报道[21-22]。

2.3 季铵盐型壳聚糖衍生物

壳聚糖季铵盐具有良好的水溶性和生物活性受到研究者的重视,是一类重要的壳聚糖衍生物。一般可以将壳聚糖季铵盐分为两大类,一类是将含有季铵盐的中间体接入壳聚糖,另一类是将壳聚糖本身2-NH2季铵化或者对壳聚糖进行氨基化修饰后再对其进行季铵化。

第一类壳聚糖季铵盐主要以2,3-环氧丙基三甲基氯化铵为中间体,向壳聚糖2位引入2-羟丙基-3-三甲基氯化铵。反应制备的壳聚糖季铵盐的溶解性和抗菌活性(MIC为10～20 mg/L)较壳聚糖有显著提高[23-24]。酰化反应也是向壳聚糖引入季铵基的一个重要手段。Rúnarsson等[25]通过酰化反应和进一步的亲核取代反应得到了一系列壳聚糖季铵盐衍生物,并对其构效关系进行了分析,结果显示疏水链的长度会影响衍生物的抑菌活性。Sajomsang等[26]合成了带有三甲铵基和3-甲基吡啶铵基的壳聚糖,并且比较了不同季铵化程度和取代基对抑菌活性的影响,结果显示相同季铵化程度时,三甲基季铵盐衍生物的抑菌活性要优于3-甲基吡啶铵盐,取代基团相同的情况下高的季铵化程度有利于抑菌活性的提高。

第二类的主要代表化合物为三甲铵基壳聚糖(TMC)。Guo等[27]通过西弗碱反应将芳香族化合物引入壳聚糖,硼氢化钠还原C=N双键后用CH3I对氨基进行甲基季铵化得到壳聚糖季铵盐衍生物,发现其对真菌的抑制活性比壳聚糖以及中间体西弗碱壳聚糖和N-取代壳聚糖的抑菌活性有很大提高。上述两类化合物都具有较好的水溶性,且抗菌活性都有较大提高。

壳聚糖季铵化后,变为阳离子大分子聚合物,其对细菌和真菌的抑菌活性得到提高[28]。Guo等[28]测定季铵盐壳聚糖,发现高分子量的壳聚糖季铵盐衍生物比低分子量有更强大的抗真菌活性。Sajomsang等[29]研究发现季铵化了的壳聚糖对须发毛菌(Trichophytonmentagrophyte)、红色发癣菌(T.rubrum)和石膏样小孢子菌(Microsporumgypseum)均表现出抑制作用,其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)分别在125～1 000 mg/L和500～4 000 mg/L范围内。通过比较抑制效果,发现其随着分子量、季铵化和疏水程度的提高,对红色发癣菌的抑制作用提高。抗真菌活性还取决于真菌的类型以及季铵化壳聚糖衍生物的化学结构。此外,Li等[30]通过氯乙酰与3种嘧啶化合物反应,合成了3种季铵盐型壳聚糖基,其对黄瓜黑星病菌(Cladosporiumcucumerinum)、褐腐病菌(Moniliniafructicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichumlagenarium)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)等均表现出了更好的抑菌活性。Napanporn等[31]研究发现在对壳聚糖进行季铵化修饰后,季铵化后的壳聚糖膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性有明显提高。

许多研究表明,季铵盐型壳聚糖的抑菌作用与其所携带的正电荷数量有关。大量正电荷可促进壳聚糖分子与菌体细胞表面带有负电荷的蛋白质、磷壁酸、脂多糖等发生絮凝作用,进而破坏细胞质膜的渗透屏障作用,导致菌体细胞的完整性破坏,营养物质流失,达到抗菌作用;或通过吸附带有负电荷的细菌,干扰细胞壁的合成,使细胞壁溶解而死亡[32-33]。

2.4 羧甲基壳聚糖衍生物

羧甲基壳聚糖是壳聚糖羧甲基化后的产物,它既保留了壳聚糖的优点又极大地提高了水溶性,应用范围得到进一步扩大。由于壳聚糖分子中存在游离氨基和活性羟基,反应时取代基团可进入O-位和N-位,则相应的产物有O-羧甲基壳聚糖[34-35]、N-羧甲基壳聚糖、N,N-二羧甲基壳聚糖[36]和N,O-羧甲基壳聚糖[36-38]。

各种羧甲基壳聚糖可以直接抑制多种微生物的生长。羧甲基壳聚糖的水溶性优于壳聚糖,这一性质使其在抑菌作用方面的应用范围进一步扩大。以羧甲基壳聚糖为载体制备的复合物使其抑菌活性得到进一步提升,抑菌效果高于羧甲基壳聚糖。如CMC-Ce/TiO2复合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌率达到99%和95%,而羧甲基壳聚糖膜对以上两种菌的抗菌率仅90%和80%[39];CMC-银/蒙脱土复合物对大肠杆菌的抑菌圈直径达到21.46 mm[40];CMC-Ag对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)的最低抑菌浓度为1 250 mg/L[41-42];羧甲基壳聚糖的西弗碱在50 mg/L浓度下即对尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、早疫病菌(Alternariasolani)和腐烂病菌(Valsamali)表现出抑菌作用,而同样浓度下的羧甲基壳聚糖则没有抑菌作用[43]。Zhong等将苯磺类化合物与羧甲基壳聚糖反应制备出羧甲基壳聚糖磺酸盐,对茎枯病菌(Phomopsisasparagi)、早疫病菌(A.solani)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的抑制率均达到50%以上[44]。部分羧甲基壳聚糖的高抑菌活性使其在食品防腐和水果保鲜中得到研究,如O-羧甲基壳聚糖可延长酱油的保存时间、抑制烟草中的主要霉菌[35, 45];羟乙基羧甲基壳聚糖对中华寿桃具有防腐保鲜功能[46]。

羧甲基壳聚糖除具备良好的抑菌活性及作为药物载体外,其优良的生物相容性和保湿性能使其成为杀菌剂、医药和食品添加剂开发中的重要材料。

2.5 壳聚糖的酯衍生物

壳聚糖上的C6-OH和C3-OH能够与酰卤在温和条件下反应,生成壳聚糖的酯衍生物。酯化反应使壳聚糖在中性条件下也能够获得更好的溶解性和生物活性。赵希荣等[47]合成并测试了对羟基苯甲酸壳聚糖酯对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抗菌性，结果表明,该酯抗菌活性大于对羟基苯甲酸庚酯,更优于壳聚糖。李晓芳等[48]以壳聚糖和对氯苯氧乙酰合成了对氯苯氧乙酰改性壳聚糖,该化合物对参试的6种常见细菌的生长均产生了影响。其中以对阴沟肠杆菌和枯草芽胞杆菌的抑菌性能最好,对大肠杆菌则基本没有表现出抑制作用。于沛沛等[49]研究了苯甲酸壳聚糖酯在中性及酸性条件下的抑菌活性,在pH 6.5时,对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为0.03%,对啤酒酵母的MIC为0.07%。壳聚糖还能与丙烯酸通过接枝共聚反应形成具备高吸水性能的树脂。这种树脂不仅吸水倍率高(684.85 g/g),且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用,其抑菌率范围为65%～75%[50]。Qin等以具有抑菌活性的磷酸酯结构与壳聚糖进行接枝反应,合成出氨基磷酸酯壳聚糖衍生物,在供试浓度(31.25～125 mg/L)下对尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的抑制率高于多氧菌素[51]。

以上研究表明,芳香酸类化合物与壳聚糖的接枝共聚是开发壳聚糖酯类杀菌活性物质的一个重要方向。通过向壳聚糖引入自身具备抑菌活性的芳香酸,如苯氧乙酸、酚羟基苯甲酸等,在保留原有活性氨基的同时引入新的抑菌活性基团,能够提高壳聚糖抑菌活性。通过开展其他类型抑菌芳香酸与壳聚糖的接枝及抑菌活性筛选,将有望发现新的壳聚糖活性衍生物。

2.6 壳聚糖的硫脲衍生物

壳聚糖硫脲衍生物是壳聚糖与硫氰基形成的衍生物。Eweis[52]、Zhong[53]和Qin[54]等分别合成了壳聚糖硫脲衍生物,并测定了产物对多种病原细菌和真菌的抑制作用。结果表明硫脲衍生物能够抑制大肠杆菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌和八叠球菌(Sarcina)等细菌,对早疫病菌、尖孢镰刀菌、胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、姜叶点霉菌(Phyllistictazingiberi)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)和镰刀菌等植物病原真菌也具有抑制作用,抑菌活性高于壳聚糖。其中酰基硫脲衍生物对大肠杆菌的MIC和MBC的最低值分别是15.62和62.49 mg/L,在50～500 mg/L浓度范围内对真菌具有显著的抑制作用,最大抑制率为66.67%[53]。在所测衍生物中,壳聚糖的氯乙酰基硫脲衍生物生物对真菌的抑制活性高于苯酰基和乙酰基硫脲衍生物,且取代程度越高抑菌活性越强。可根据这一特点对壳聚糖硫脲衍生物做进一步研究开发,通过优化合成途径、提高取代度和产率,为壳聚糖硫脲衍生物在杀菌剂领域的应用奠定基础。

2.7 壳聚糖的氨基酸衍生物

壳聚糖的氨基酸衍生物在近两年得到发展,精氨酸壳聚糖是目前研究较多的氨基酸取代壳聚糖衍生物。Tang等[55]以壳聚糖制备了6%精氨酸取代和30%的精氨酸取代产物。两种不同的精氨酸壳聚糖衍生物均能强烈抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。5 000 mg/L的6%和30%取代的精氨酸壳聚糖处理,4 h内分别杀死了金黄色葡萄球菌2.7 logs和4.5 logs,以及大肠杆菌4.8 logs和4.6 logs。浓度在0～512 mg/L范围内,6%精氨酸取代壳聚糖的抑菌效果在整个测量过程中高于30%精氨酸取代壳聚糖,且浓度越大差距越大。Xiao等[56]制备出取代度在8.7%～28.4%范围的壳聚糖-N-精氨酸,该类化合物在高于150 mg/L浓度时能够抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长,在低于50 mg/L浓度时能够促进细菌的生长。

尽管壳聚糖与氨基酸接枝衍生物的抑菌活性研究刚起步,但现有的结果表明其具有进一步研究开发的潜力。

2.8 壳聚糖的配合衍生物

壳聚糖的多氨基和多羟基结构及直链高分子态使其能够与多种分子及金属元素形成配合物。如壳聚糖与硼酸盐形成的壳聚糖-硼酸盐交联分散粒子,对金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌(Aspergillusniger)和镰刀菌(Fusariumsolani)都有抗菌性能,表现出广泛的抗菌谱[57]。Roller等[58]研究了壳聚糖谷氨酸盐对十余种酵母菌和霉菌的生长抑制作用。发现在平板及苹果汁中,壳聚糖物质在100～5 000 mg/L范围浓度内,除3株丝状真菌外,对其余12种供试酵母和霉菌的生长均有明显的抑制作用。此外,壳聚糖可与Ag、Zn、Ce、ZnO和Sm等金属元素或其氧化物形成配合物,提高了对多种病原细菌和真菌的抑制作用[59-66]。

3 问题与展望

关于壳聚糖衍生物抑菌活性的研究已有许多报道,科研人员一直尝试从中寻找高活性的衍生结构。综上所述,通过壳聚糖的结构改造,其理化性质得到改善,生物活性进一步提高。基于壳聚糖分子的正电荷数量与其抑菌效果成正相关的研究结果,壳聚糖衍生化的主要方向之一是通过衍生化提高壳聚糖分子上氨基的数量或正电荷强度,或者向壳聚糖其他位置接入活性基团来提高其抑菌活性。但也有研究人员发现壳聚糖其他类型的衍生物,如壳聚糖的酯和硫脲衍生物同样表现出较好的抑菌活性[53,67]。

因此,要获得具有高抑菌活性的壳聚糖衍生物,还应从以下两个方面开展研究。

(1)在已有合成和活性测定研究的基础上,有针对性地合成壳聚糖衍生物,开展壳聚糖衍生物结构与抑菌活性间的构效关系研究。目前经合成并测定抑菌活性的壳聚糖衍生物种类和数量繁多,通过积累不同类型的壳聚糖衍生物及活性数据,探索结构-活性间的基本规律。现有对壳聚糖及衍生物的抑菌构效关系研究多集中在定性水平,仅能从已有活性数据对衍生物是否存在活性进行判断,但无法对新活性壳聚糖衍生物的设计和合成提供有效的指导意见。在定性构效关系探讨的基础上借助聚合物构效分析软件(如Material Studio)对其定量构效关系进行研究,可以为高抑菌活性壳聚糖衍生物的定向设计和制备提供参考。

(2)壳聚糖及其衍生物抑菌机理研究。不同分子量及脱乙酰度的壳聚糖对微生物表现出不同的作用方式和作用位点,研究人员普遍认为低分子量壳聚糖分子进入微生物细胞影响核酸功能,而高分子量壳聚糖则主要通过破坏细胞膜功能引起微生物死亡[68-69]。然而,对于壳聚糖衍生物抑菌作用机理的研究至今还未见报道,因此对壳聚糖及其衍生物的作用机理进行深入研究具有重要意义,能够指导活性化合物的设计和合成。

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(责任编辑：田 喆)

Research progress on chitosan derivatives and its antibacterial activity

Hu Linfeng1,2, Xing Rong’e1, Liu Song1, Qin Yukun1, Chen Xiaolin1, Li Pengcheng1

(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. School of Chemistry & Chemical Engineering, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

Chitosan is the only animal fibers and alkaline polysaccharide ever found till now, with a variety of unique biological activities, such as antimicrobial and antitumor activity. The derivation of chitosan is an effective method to improve its physicochemical properties and to raise its biological activities. In this paper, research progress on structure design, synthesis and antimicrobial activity of chitosan derivatives are discussed, including alkylated chitosan, aminoin chitosan, quaternary salt chitosan, carboxymethyl chitosan and other chitosan derivatives grafted with ester, sulfourea or amino acid. On the other hand, the paper focused on the antibacterial and antifungal activities of chitosan derivates. It is urgent to carry out studies on the relationship of the structure and antimicrobial activity of chitosan derivatives, and explore the mechanism of the high antimicrobial activity of chitosan derivates in the field of development of application of chitosan and its derivates with strong antimicrobial activity.

chitosan; chitosan derivatives; antimicrobial activity; antimicrobial mechanism

2014-02-17

2015-01-17

海洋公益性行业科研专项(201305016-2, 201405038-2)；国家“863”项目(2011AA09070405)

S 482.292

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.001

* 通信作者 E-mail:pcli@qdio.ac.cn