酱渣蛋白提取方法与工艺优化的研究

舒冬梅，王德良，宋绪磊，靳 伟，尚 柯

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.中国食品发酵工业研究院，北京100015；3.新疆农业大学机械交通学院，新疆乌鲁木齐830052）

酱渣蛋白提取方法与工艺优化的研究

舒冬梅1，王德良2*，宋绪磊2，靳 伟3，尚 柯1

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.中国食品发酵工业研究院，北京100015；3.新疆农业大学机械交通学院，新疆乌鲁木齐830052）

为了回收利用酱渣资源，本实验探索酱渣蛋白质提取方法，优化提取工艺条件。结果表明，响应面法对超声辅助提取酱渣蛋白的优化工艺条件为超声功率365 W，料液比1∶37(g∶mL)，提取液pH值9.8，超声时间50 min。在此最佳提取工艺条件下，酱渣蛋白的提取率为73.69%。

酱渣；蛋白质；提取方法；工艺优化

酱油起源于中国，是一种传统且美味的调味剂，在中国的发展至少有2 500年的历程，公元17世纪经过文化的传播流入日本[1]。酱油生产的主要原料是脱脂大豆、豆粕、麸皮与面粉。酱渣也称酱油渣，是指酿造酱油的过程中产生的含水固体残渣[2]。由于酱渣难于运输和储藏，酱油酿造厂通常没有通过合理回收便低价出售到市场以作肥料或饲料，有的甚至丢弃，造成环境污染和资源的严重浪费[3]。据相关部门统计，2013年我国酱油年产量达750万t，而且其产量规模每年以10%的速度递增[4]。依据生产1 kg酱油将会产生0.67 kg酱油渣（含水分75%）计算，2014年我国生产825万t酱油，约产生550万t酱渣[5]。酱渣呈深棕色，其中主要成分有粗蛋白质含量约30%[6]，粗脂肪约9.7%，植物粗纤维约13.5%，灰分10.5%，另外，酱渣还含具多种生理活性的天然营养因子—异黄酮[7]。陈恩赞等[8]采用微波法提取酱油废渣中的总异黄酮，酱渣总异黄酮浸出率达到90%以上。高献礼等[9]用丙酮沉淀方法提取酱油渣蛋白进行分离、鉴定。SHARMA P C等[10]用碱提酸沉法提取杏仁中的蛋白，料液比1∶20，碱提pH 8.0，酸沉pH值4.0，结果杏仁蛋白提取率为71.3%。马秀婷等[11]采用超声波辅助提提豆渣中蛋白，最佳工艺为温度51.0～53.4℃，超声时间28.8～30.7 min，功率398.1～399.3 W，最终蛋白提取率达到80.19%。国内外对蛋白提取方法主要集中在碱提酸沉法、超声辅助碱提法、硫酸铵沉淀法、丙酮提取等方面，但是对于酱渣蛋白的提取方法的探究较少。本研究采用不同方法对酱渣蛋白进行提取和对比，并运用超声波辅助碱提法对酱渣提取工艺进行优化，为更好的开发利用酱渣资源提供参考，同时也为进一步研究酱渣蛋白性质提供前期理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱渣：中国食品发酵工业研究院提供；氢氧化钠、硼酸、硫酸钾：北京化工厂；盐酸：天津市化学试剂一厂；硫酸铜、硫酸：国药集团化学试剂（北京）有限公司；Novozyme碱性蛋白酶（200000U/g）、Novozyme纤维素酶（22500U/g）：上海碧莱清生物科技有限公司；三氯乙酸：上海宏瑞化工有限公司；丙酮：济宁华凯树脂有限公司。所有化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FW80型高速万能粉碎机：上海科恒实业发展有限公司；XPE105分析天平：METTER TOLEDO公司；DF204型鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；LR10-2.4A型高速冷冻离心机：北京雷勃尔医疗器械有限公司；PHS-3C型pH计、HH-5Y11-Hiz恒温水浴锅：上海仪电科学仪器股份有限公司；ELECTROLUX超声波萃取仪：北京弘祥隆生物技术公司；BCD-251e型冰箱：ELECTROlux（中国）电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同方法提取酱渣蛋白质

酱渣在40℃条件下烘干至质量恒定，用高速万能粉碎机粉碎，经过40目筛过滤后进行蛋白提取。具体方法如下：

（1）盐提法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入0.3 mol/L氯化钠溶液，在55℃的水浴锅中浸提4 h。

（2）磷酸缓冲液提取法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入磷酸缓冲液（pH9.5，浓度0.05mol/L，其中含2 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、0.1 mol/L KCl），4℃冰箱内浸提4 h。

（3）超声波辅助碱提酸沉法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入蒸馏水，并用1 mol/L NaOH，调节混合液pH 9.5，超声温度为55℃，超声时间为35 min，超声功率为400 W。

（4）碱性蛋白酶提取法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入蒸馏水，调节混合液pH 9.5，置于55℃水浴中，加入酱渣质量1%蛋白酶，浸提4 h后80℃水浴灭酶20 min。

（5）碱提酸沉法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入蒸馏水，调pH值至9.5，置于55℃的水浴中浸提4 h。

（6）水提法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入蒸馏水，置于55℃水浴，浸提4 h。

（7）三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-丙酮法[12]：取酱渣粉3 g，加入预冷的10 mL三氯乙酸（TCA）-丙酮溶液（含体积分数10%TCA、0.07%β-巯基乙醇），充分混匀后，在-20℃静置1 h，4℃、8 000 r/min条件下离心15 min。去上清液的沉淀用预冷的丙酮（-20℃，含0.07%β-巯基乙醇）悬浮，在-20℃冰箱内浸提过夜。在4℃、8 000 r/min条件下离心10 min，去上清液留沉淀，再加入经预冷的丙酮进行浸提，1 h后相同条件离心，弃上清液，收集沉淀。

（8）纤维素酶法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入蒸馏水，调节混合液pH 9.5，置于55℃水浴中，加入酱渣质量1%的纤维素酶，浸提4 h后80℃水浴灭酶20 min。

（9）混合酶法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入蒸馏水，调节混合液pH9.5，置于55℃水浴中，加入酱渣质量1%的碱性蛋白酶和纤维素酶，浸提4 h后80℃水浴灭酶20 min。

按照上述的条件处理后，在4℃、8 000 r/min条件下离心15 min，保留上清液；将沉淀用蒸馏水洗涤后再相同条件离心，取两次上清液混合均匀调pH值至4.5，在45℃水浴30 min，离心（三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-丙酮法除外）。沉淀经真空冷冻干燥即为酱渣蛋白质粗提物，计算酱渣蛋白质提取率，其计算公式如下：

式中：A为提取的蛋白质质量，g；B为酱渣蛋白质总质量，g。

1.3.2 单因素试验设计

采用超声辅助碱提法，对各影响因素进行单因素试验，研究超声功率、超声时间、料液比和提取液pH值对酱渣蛋白提取率的影响。

1.3.3 响应面法试验设计

根据单因素试验结果，利用响应面优化原理[13]，以酱渣蛋白提取率（Y）为响应值，采用Design-Export软件中Box-Behnken试验对酱渣蛋白提取工艺进行优化，Box-Behnken试验设计的因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 不同方法的酱渣蛋白提取率

由图1可知，酱渣蛋白提取方法不同，酱渣蛋白的提取率有很大差异，各种酶法提取的酱渣蛋白提取率高（碱性蛋白酶75.46%，纤维素酶65.98%，混合酶73.15%），TCA-丙酮法75.24%、超声波辅助提取57.67%、碱提酸沉法54.35%等。碱性蛋白酶的提取率最大为75.46%，但是碱性蛋白酶本身是蛋白，对酱渣蛋白的定性和定量检测会造成干扰，纤维素酶和混合酶同理。TCA-丙酮法蛋白提取方法可能引起蛋白质变性。综合分析，超声辅助提取运用超声波的空化效应，并且结合碱提酸沉法更加方便快捷，蛋白提取率可以达到57.67%，说明该方法可行，以下单因素试验均采用超声波辅助碱提酸沉法。

2.2 提取工艺优化单因素试验

2.2.1 超声波功率对酱渣蛋白质提取率的影响

称取2 g酱渣，料液比1∶30（g∶mL）、超声时间40 min、提取液pH值为9，分别在超声功率0、200 W、250 W、300 W、350 W、400 W条件下提取。蛋白质提取液经离心后取上清液调pH值至4.5，在45℃水浴离心30 min，沉淀经真空冷冻干燥，考察不同的超声功率对酱渣蛋白质提取率的影响，结果见图2。

由图2可知，超声功率增大，有利于酱渣蛋白溶出，酱渣蛋白质提取率随超声功率增大而提高[14]。虽然超声功率大，蛋白提取率增加，但是植物蛋白结构在过高超声功率作用下可能改变，所以选取超声波功率为350 W来进行超声波辅助碱提酸沉法提取酱渣蛋白质。

2.2.2 超声作用时间对提取率的影响

称取2 g酱渣，在料液比1∶30（g∶mL）、提取液pH值为9，超声功率350 W条件下，超声时间分别设定20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min对酱渣蛋白进行提取。提取液经离心后取上清液调pH值至4.5，在45℃水浴离心30 min，沉淀经真空冷冻干燥，考察不同的超声时间对酱渣蛋白质提取率的影响，结果见图3。

由图3可知，超声辅助碱法提取酱渣蛋白质提取率随时间增加先提高后稍有降低，时间＜50 min，随时间延长提取率不断提高；当时间到达50 min时酱渣蛋白质提取率达到最大值56.7%；时间＞50 min，蛋白质提取率降低。可能由于干燥的酱渣粉与水间需要一定的溶胀时间，足够的溶胀时间利于蛋白质的分离溶解[15]，但若提取时间过长，则可能有部分蛋白质由于超声波产生热量而使出现凝聚沉淀，在后续的离心步骤中随沉淀被除去，所以超声时间选50 min为宜。

2.2.3 料液比对酱渣蛋白质提取率的影响

称取2g酱渣，在超声功率350W，超声时间50min，提取液pH值为9，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL）条件下进行酱渣蛋白质提取。提取液经离心后取上清液调pH值至4.5，在45℃水浴离心30 min，沉淀经真空冷冻干燥，考察不同的料液比对酱渣蛋白质提取率的影响，结果见图4。

由图4可知，料液比在1∶10～1∶30（g∶mL）范围内，随着料液比的提高，酱渣蛋白质提取率提高，但是料液比＞1∶30（g∶mL）以后，蛋白质提取率稍有下降。但是料液比继续增大时，短时间内酱渣蛋白浸提就达到了饱和，不利于酱渣蛋白的提取。酱渣中水的比例过高也不利于蛋白提取后的沉淀浓缩，综合考虑，料液比选取1∶30（g∶mL）比较合适。

2.2.4 提取液pH值对酱渣蛋白质提取率的影响

称取酱渣2 g，在超声功率350 W，超声时间为50 min，超声温度50℃的条件下，提取液pH值分别为7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的条件下进行酱渣蛋白提取。提取液经离心后取上清液调pH值至4.5，在45℃水浴离心30 min，沉淀经真空冷冻干燥，考察不同的提取液pH值对酱渣蛋白质提取率的影响，结果见图5。

由图5可知，当提取液pH值为9.5时，蛋白质提取率最大达到62.9%，因为碱性条件下蛋白质发生酸式解离，使其本身带相同的负电荷而相互排斥，蛋白质在水分子中的分散性增加。同时碱性条件对蛋白质的氢键有一定的破坏作用，增加蛋白的亲水性。但是碱性过强的环境破坏蛋白质结构和构象，使部分埋藏在蛋白质内部的羧基、酚羟基和巯基离子化甚至失去生物活性[16]。此外，碱性过强的环境会改变蛋白质的营养学特性，生成赖氨酰丙氨酸，这种物质对身体有害毒，引起蛋白营养物质的损失[17]。再者，高碱条件加速美拉德反应引入黑褐色物质，杂质增加，影响蛋白分离纯化效果[17]。所以在酱渣蛋白质提取时提取液pH值选取9.5比较适宜。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 响应面试验设计与结果分析

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken的中心组合试验设计，以超声功率、料液比、提取液pH值、超声时间4个因素为自变量，以酱渣蛋白提取率为响应面的目标值，进行4因素3水平共进行29组独立试验，其中独立试验为24个，0水平重复试验5个用来估算试验误差。Box-Behnken试验设计及结果见表2。

利用Design-Export对表2试验数据进行方差及回归分析，得到酱渣蛋白质提取率对各变量的二次多项回归模型为：

为了检验回归方程的有效性，对该数学模型进行回归方差分析显著性检验，结果见表3。

由表3可知，模型P＜0.000 1，回归模型极显著。模型的一次项A、B、C、D极显著，二次项A2、B2、C2、D2极其显著，交互项AD、BC极显著，AC、AB、BC、CD不显著。结果表明，这四种因素对酱渣蛋白提取率的影响并不是简单的线性关系，失拟项P为0.113 3＞0.05，不显著，相关系数R2=0.922 8，说明模型的拟合程度较好，此模型可以用来分析和预测超声波辅助碱法提取酱渣蛋白的提取率。

2.3.2响应面分析与优化

由图6可知，超声功率340～370 W，料液比1∶30～1∶38（g∶mL），提取液pH值在9.48～9.85，超声时间48～54 min时酱渣蛋白提取率＞70%。响应面法对超声辅助提取酱渣蛋白提取率的优化结果为超声功率365.08 W，料液比1∶36.59（g∶mL），提取液pH值为9.82，超声时间51.64 min，在此条件下预测酱渣蛋白提取率为75.55%。

2.3.3 验证试验

为了检验响应面模型的有效性，实际操作过程中选择超声功率365 W，料液比1∶37（g∶mL），提取液pH值为9.8，超声时间50min，此条件下酱渣蛋白提取率平均值为73.69%，与响应面预测值75.55%相差1.86%，说明响应面优化是可行性，可以通过回归方程对酱渣蛋白提取率进行预测。

3 结论

响应面法对超声辅助碱法提取工艺优化结果：超声功率365 W，料液比1∶37（g∶mL），提取液pH值为9.8，超声时间50 min，此条件下酱渣蛋白提取率平均值为73.69%。本试验为酱渣资源的合理开发与利用提供了新思路，为酱渣蛋白的定性和定量分析提供基本原料。

[1]FUKUSHIMA D.Fermented vegetable(soy bean)protein and related foodsofJapanandChina[J].J Am Oil Chem Soc,1979,56(15):358-359.

[2]韩丽，刘晓，李国兴，等.酱油渣和醋渣的开发利用[J].粮食与饲料工业，2005（3）：32-33.

[3]边名鸿，宗绪岩，左勇，等.多菌种协同发酵酱渣生产蛋白质饲料的工艺优化[J].饲料研究，2012（8）：83-85.

[4]李学伟，朱新贵，刘滢，等.黄豆酱油渣油脂和膳食纤维的制备研究[J].中国酿造，2013，32（10）：109-112.

[5]马良，王昌禄，范寰，等.酱油渣资源化利用现状及其饲料化发展前景[J].农业环境与发展，2010（2）：25-28.

[6]沈晗，金志刚，孙宝国，等.超声辅助双酶分步酶解酱渣蛋白的响应面条件优化[J].中国酿造，2010，29（3）：21-27.

[7]DELMONTE P,PERRY J,RADER J.Determination of isoflavones in dietary supplements containing soy,red clover and kudzu:extraction followed bybasic or acid hydrolysis[J].Chromatogr A,2006,1107(1-2): 59-69.

[8]陈恩赞，苏海佳，谭天伟.微波提取中总异黄酮试验研究[J].环境工程学报，2010，4（2）：427-430.

[9]高献礼，赵斯薇，孙鹏飞，等.酱油渣蛋白质的分离、鉴定和氨基酸组成特征研究[J].现代食品科技，2013，29（10）：2512-2516.

[10]SHARMA P C,TILAKRATNE B M K S,GUPTA A.Utilization of wild apricot kernel press cake for extraction of protein isolate[J].Food Sci Technol,2010,47(6):682-685.

[11]马秀婷，肖志刚，孙旭.超声波辅助提取豆渣蛋白工艺优化[J].食品与机械，2013，29（1）：108-112.

[12]李莹莹，吴彩娥.白果蛋白提取及SDS-PAGE分析[J].食品科学，2010，31（22）：37-40.

[13]吕娜，刘阳，崔艳艳，等.响应面法优化超声波提取山荆子总黄酮工艺[J].中国酿造，2014，33（2）：71-74.

[14]王晶，马文君，陈勇，等.超声辅助提取黑豆蛋白及其功能性质的研究[J].食品工业科技，2014，35（21）：86-90.

[15]陆晨，邹雨虹，张士康，等.响应面法优化超声辅助提取茶渣蛋白质的工艺条件[J].食品与生物技术学报，2012，31（3）：319-325.

[16]周瑞宝.植物蛋白功能原理与工艺[M].北京：化学工艺出版社，2007.

[17]SHIH F F,DAIGLE K.Use of enzymes for the separation of protein from rice flour[J].Cereal Chem,1997,74(4):437-441.

Extraction methods and process optimization of soy sauce residue protein

SHU Dongmei1,WANG Deliang2*,SONG Xulei2,JIN Wei3,SHANG Ke1
(1.College of Food Science and Medicine,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China; 2.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100015,China; 3.College of Mechanical and Traffic,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

To recycle soy sauce residue resources,extraction method of sauce residue protein was studied,and extraction process conditions were determined.Through response surface methodology,the extraction conditions were optimized as follows:ultrasonic power 365 W,liquid-solid ratio 1∶37(g∶ml),pH 9.8,ultrasonic time 50 min.Under this condition,the protein extraction ratio from soy sauce residue was 73.69%.

soy sauce residue;protein;extraction methods;process optimization

S816.46

A

0254-5071（2015）06-0067-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.015

2015-05-18

科技部院所基金项目（2014EG111217）

舒冬梅（1988-），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。

*通讯作者：王德良（1971-），男，教授，博士，研究方向为中国传统食品发酵工艺的研究。