纳米铝佐剂禽流感疫苗（H5N1）免疫反应性试验

徐爱平，蒋　勇，湛淋丽（.重庆市农业学校，重庆九龙坡4039；.重庆市巴南区花溪街道畜牧兽医站，重庆巴南400045）

纳米铝佐剂禽流感疫苗（H5N1）免疫反应性试验

徐爱平1，蒋勇1，湛淋丽2
（1.重庆市农业学校，重庆九龙坡401329；2.重庆市巴南区花溪街道畜牧兽医站，重庆巴南400045）

摘要：通过自制纳米氢氧化铝佐剂,免疫肉鸡。检测发现初期油苗吸收不良，随着日龄的增加，油苗逐渐被吸收形成淡黄色的痕迹，而后逐渐被吸收；纳米佐剂组疫苗在初期吸收良好，淡黄色的痕迹很快被吸收、肌肉表现潮红。49 d时，纳米组炎性细胞已经被吸收殆尽，仅在毛细血管周围残存尚未被完全吸收的炎性细胞；常规铝组的炎性细胞也明显减少，而油苗组仍有大量炎性细胞未被吸收，炎灶明显，说明与油苗相比，纳米疫苗可以降低佐剂的副作用。

关键词：禽流感；纳米铝佐剂疫苗；反应性；免疫

高致病性禽流感（HPAI）是由A型流感病毒引起的一种禽类感染疾病的综合征，它分布广，传播快，国际动物卫生组织（OIE）已将其列为必须报告疫病（notifiable disease），我国也将其列为一类动物疫病。该病流行已有数百年历史，其造成的损失数不胜数。自1997年我国香港地区暴发禽流感，并发生H5N1亚型AIV致人死亡之后，该病毒致人死亡的事件频频发生。目前，我国防控HPAI的有效途径是注射油乳剂灭活疫苗。但油佐剂刺激性大、不易被机体吸收，容易在注射部位形成肿块，影响生产性能。另外，有研究表明，对于生长周期较短的肉鸡，在其宰杀销售之时仍有部分油佐剂残留于机体，严重影响产品质量，因此寻找副作用小的禽流感免疫保护的新型疫苗佐剂，具有重要的应用前景。目前，纳米颗粒多用作药物载体，增加药物的靶向性和缓释效应，但用做疫苗佐剂的相关报道不多。1981年Kreuter等首次将纳米材料应用于疫苗佐剂发现，流感病毒抗原与多聚甲基丙烯酸酯纳米颗粒聚合制作的流感病毒疫苗可保护小鼠免受鼠流感病毒侵袭。1995年Kossovsky等证明，表面修饰的纳米粒子能使蛋白抗原的表面充分暴露，同时使抗原结构更稳定，并能促进淋巴集结的摄取，在兔体内能引起强烈的、特异的免疫反应。在国内，汤承，吕风林等将纳米氢氧化铝佐剂用于兽医疫苗也发现，纳米材料是一种很好的新型免疫佐剂。本文就纳米疫苗的制作做简要阐述，以及肉鸡注射疫苗后的反应进行了观察和检测。

1　材料与方法

1.1主要材料禽流感标准抗原和标准阳性血清；纳米AI（OH）3佐剂；常规AI（OH）3佐剂；油佐剂啇品疫苗；灭活病毒尿囊液；禽流感病毒H5亚型荧光PCR检测试剂盒；常用外科手术器械；数码相机；病理实验室常规器械（组织切片机，天平等）。

1.2纳米AI（OH）3佐剂的研制采用W/O型微乳液制备纳米氢氧化铝佐剂粒子即微乳液法。配置相应浓度与规格的试剂，在恒温磁力搅拌器上置水浴缸，使水温升高到50℃。调整铁架台。向水浴缸中烧杯依次加入：环己烷10 mL，丙三醇1 mL，无水三氯化铝1 mL，苯扎溴铵0.3 mL；通过事先固定在铁架台上的分液漏斗滴加氨水（约30 滴/min，尽量缓慢滴入氨水），并用搅拌子对烧杯中的混合液进行搅拌。再向其中加入50 mL高纯水，搅拌2 h后，并逐步降低水温。最后将做好的样品注入高压均质机中，10 000 psi处理，5个循环后的处理液即为制备的纳米氢氧化铝佐剂。用激光粒度仪对其粒径进行测定，并用常规氢氧化铝作为对照，最后用络合滴定法测定纳米氢氧化铝的含量，使得铝的含量不超过国家的标准。

1.3纳米AI（OH）3佐剂灭活疫苗的研制

1.3.1尿囊液抗原的测定用血凝（HA）试验测定尿囊液效价、荧光实时RT-PCR测定禽流感病毒阴阳性、单向放射免疫扩散技术检测血凝素含量，具体方法略。

1.3.2抗原离心沉降率测定分批取解冻混匀后的禽流感灭活尿囊液于离心管中，分别以6 000、7 000、8 000、9 000、12 000、15 000、18 000、20 000 r/min，离心30 min后，取上清液，用血凝试验（HA）方法检测其效价。

1.3.3纳米氢氧化铝离心沉降率测定分批取0.8 mg/mL纳米氢氧化铝于离心机中，分别以600、700、800、6 000、7 000、8 000、14 000、15 000 r/min离心30 min后，取上清液，用络合滴定法测定其铝浓度。

1.3.4温度、时间、铝浓度影响吸附率的测定参照现行油苗抗原与佐剂配比，取解冻混匀后的灭活病毒尿囊液1份，分别加入纳米氢氧化铝液和常规氢氧化铝液2份（铝终浓度0.600～1.000 mg/mL），分别置25℃和4℃中摇床振荡吸附2 h 和4 h，经7 000 r/min离心30 min后取上清液，分别用HA试验、荧光RT-PCR检测抗原，用络合滴定法检测铝的浓度。

1.3.5纳米和常规氢氧化铝佐剂辅佐疫苗的制备在以上步骤筛选的最佳条件下，以尿囊液与佐剂1∶2的体积比配制疫苗，最后加入0.01%防腐剂硫柳汞，制成本试验中所用的疫苗。

1.4试验动物分组及处理500只1日龄健康荣昌青脚肉鸡购自重庆市荣昌县广顺养殖场，观察并饲养于西南大学荣昌校区实验动物基地。至雏鸡10日龄时，逐只按《高致病性禽流感诊断技术》（国家标准GB/T18936-2003）中血凝抑制(HI)试验方法检测其AIV抗体滴度。选用母源抗体一致的动物240只，每组60只。14日龄时，第1组接种自制纳米铝佐剂禽流感H5N1灭活疫苗0.5 mL/只；第2组接种禽流感H5N1亚型油佐剂啇品疫苗0.5 mL/只；第3组接种自制常规铝佐剂禽流感H5N1灭活疫苗0.5 mL/只；第四组注射灭菌生理盐水0.5 mL/只。21日龄，35日龄时，油苗组、纳米组和常规铝佐剂组随机抽取2只鸡，脱颈处死，剥离皮肤，选取试验部位与对照部位进行肉眼观察，剖开疫苗注射部位肌肉（左侧）与右侧未注射疫苗部位进行肉眼对比，并拍摄照片。另外，21、35、49日龄分别选取试验部位典型部分取肌肉组织块进行常规切片。

2　结果与分析

2.1眼观检查见中插彩版图1～3。

由图1～3可知，纳米组疫苗吸收很快，21日龄能看见少许未吸收的疫苗，但35日龄时疫苗基本吸收，注射部位无明显可见的残余物；常规铝组21日龄可见吸收不完全的淡黄色残余物，35日龄时油苗组疫苗才基本吸收，只见少量剩余的淡黄色残余物；而油苗组21日龄注射部位可以看到明显没有吸收的油苗，剖开之后乳白色未吸收油苗清晰可见，甚至是35日龄肉鸡注射部位仍然可见没有吸收的淡黄色残余物。

2.2病理组织学观察见中插彩版图4～6。

常规H.E.染色表明，在21日龄时纳米组、常规铝组和油苗组炎性细胞浸润剧烈，肌纤维间充满炎性细胞，肌纤维扭曲变形明显，注射部位形成炎灶。35日龄时，纳米组炎灶逐渐缩小，而油苗组和常规铝组仍表现很强炎性细胞浸润。49日龄时，纳米组炎性细胞已经被吸收殆尽，仅在毛细血管周围残存尚未被完全吸收的炎性细胞；常规铝组的炎性细胞也明显减少，而油苗组仍有大量炎性细胞未被吸收，炎灶明显。对照组没有明显变化，肌纤维完整。

3　讨论

从表观观察结果分析，21日龄、35日龄各组的肌肉注射部位反应不同。初期油苗吸收不良，随着日龄的增加，油苗逐渐被吸收形成淡黄色的黏稠状物痕迹，而后逐渐被吸收；纳米佐剂组的初期吸收良好，淡黄色的痕迹很快被吸收、肌肉表现潮红。常规铝组的吸收情况略逊于纳米组，21日龄只有吸收不完全的残余物，35日龄时，基本吸收完全。以上说明纳米氢氧化铝用做HPAI H5N1的免疫佐剂可以使疫苗更好的被机体吸收。

肉鸡注射油苗后，因矿物油不能完全代谢，故可在组织中长时间存在，一但被人食用，则有致癌的可能性，随着人们生活水平的日益提高，对动物产品质量安全也提出了更高的要求，为了保证养殖业持续、健康发展和健康安全的畜禽产品的正常供应，油佐剂的缺点越来越有待于解决。目前，使用纳米氢氧化铝佐剂辅佐HPAI H5N1免疫肉鸡对胴体品质的研究还未见报道，但与油佐剂相比，纳米佐剂无疑可以排除矿物油残留的可能，改善生长期短的肉鸡的胴体品质。

从肌肉组织H.E.染色切片来看，随着日龄不同，各组炎症出现时间与轻重不同，免疫后随着日龄的增加炎症反应逐渐增强，由于佐剂的不同炎症反应逐渐消退的时间有很大差异：纳米组在21日龄表现很强的炎性反应，炎灶形成，炎灶附近肌纤维间充满炎性细胞，至35日龄炎性反应即降低，炎灶局限，至49日龄时炎灶基本消除殆尽，肌纤维恢复，仅在毛细血管周围尚存部分未被吸收的炎性细胞，毛细血管管壁结构恢复，游离炎性细胞散在。油苗组和常规铝组在21日龄也表现很强的炎性反应，炎性细胞浸润，炎灶形成，35日龄时在注射位点附近炎灶肌纤维间充满炎性细胞，随着时间的推移至49日龄时油苗组仍然有很多炎性细胞未被吸收，肌纤维间炎性细胞基本消失，炎灶仍清晰可见，常规铝组炎性细胞明显减少。从整个炎症过程看，符合炎症基本过程，初步证实为免疫介导性肌炎，只是时间上有所不同。

参考文献：

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[2] Kreuter J，Haenzel I . Mode of action of immunological adjuvants [J].Eur J Immunol，1981，11：1012-1016.

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[4]汤承，岳华，吕凤林，等.纳米铝佐剂诱导鸡提前产生抗AIV H9体液免疫应答[J].西南民族大学学报·自然科学版，2006，32（5）：956-958.

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[6]王明俊.兽医生物制品学[M].北京：中国农业出版社，1997：147-148.

Theimmunoreactivity research of AIV H5N1 Subtype Vaccine Assissting by Nanoparticulated Aluminum Hydroxide Adjuvant

XU Ai-ping1，JIANG Yong1，ZHAN Lin-li2
（1.Chongqing Municipal Agricultural School，Chongqing 401329，China；2.Chongqing Huaxi District of Animal Husbandry and Veterinary Station，Chongqing 400045，China）

Abstract：Using the self-made Nano aluminum hydroxide as adjuvant，we immunized broilers with H5N1 vacine. As age in⁃creased，oil-adjuvant vaccine was absorbed，which left yellow traces. Nano adjuvant was absorbed quickly，and there were no yel⁃low traces left. After 49 days，no inflammatory cells were observed in the nano adjuvant injected area except some around the blood capillarie. Inflammatory cells in the conventional aluminum group were also significantly reduced, while the oil group still had a lot of inflammatory cells observed in the injection area. Compared with oil adjuvant，nano adjuvant can reduce the side effects.

Key words：Avian influenza；Nanoparticulated Aluminum Hydroxide Adjuvant；Immunity Reactivity

作者简介：徐爱平（1983-），女，讲师，硕士，从事畜牧兽医教学工作，E-mail：tracy520927@163.com

收稿日期：2014-04-18

中图分类号：S858.31

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2015）10- 0084- 03