动物试验替代方法在兽用疫苗检验中的应用概况

王晓卉，李 翠，蒋 卉，张秀英，温 芳，陆连寿，王在时

（中国兽医药品监察所，北京100081）

动物试验替代方法在兽用疫苗检验中的应用概况

王晓卉，李 翠，蒋 卉，张秀英，温 芳，陆连寿，王在时∗

（中国兽医药品监察所，北京100081）

介绍了动物试验替代方法的含义及其在国内外的发展情况，并从实验动物替代法、血清学替代法和疫苗抗原定量法三方面重点介绍了动物试验替代方法在兽用疫苗检验中的应用情况、优势和意义，以期为兽用疫苗检验替代方法研究提供参考。

动物试验替代方法；兽用疫苗检验

1 动物试验替代方法概述

1959年，在英国动物学家William与Rex共同出版的专著《The Principles of Humane Experimental Technique》中，最早提出了减少（Reduction）、替代（Replacement）、优化（Refinement）（简称 3R）原则［1］，其具体的含义为：减少科学研究活动中的动物使用量，探索能够达到相同目的或获得相同结果的动物试验替代方法，采用一切可行的技术和手段，使动物免受试验所造成的痛苦、不安和疼痛或／和改善生活环境，从而提高动物生存质量的优化方法［2］。1978年，David Smyth教授出版了《动物试验替代方法（Alternatives to Animal Experiments）》一书，提出用替代（Alternatives）来给3R做了概括［3］。3R是现今动物试验替代方法（Alternative Methods）的核心和主要研究内容，是动物试验替代方法的发展方向，有时就是替代试验代名词［4］。

为了推动动物替代技术的发展，国外成立了许多相关的研究组织和管理机构，并投入大量经费资助相关的科学研究，以促进新技术新方法的开发和应用，如美国霍普金斯动物试验替代方法研究中心（The Johns Hopkins center for Alternatives to Animal Testing，CAAT）、欧洲替代方法验证中心（European center forthe validation ofalternative methods，ECVAM）、美国机构间替代方法评价协调委员会（The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Method，ICCVAM）等等。除了设立机构之外，许多国家还都制定了动物保护相关法规或发布管理条例、行业规范对动物试验予以约束。如1876年英国颁布的世界上第一部涉及有动物试验内容的法规《防止虐待动物法》［3］，美国《动物和动物产品法》和《人道主义饲养和使用实验动物的公共卫生方针》也明确规定了3R原则在动物试验方面的应用［5］。

我国动物福利起步较晚，与国外相比，我国在这方面差距较大，但目前也正在逐步与国际接轨。1997年，原国家科委等四部委联合发布的《关于“九五”期间实验动物发展的若干意见》，是第一次把3Rs的基本概念写进实验动物工作管理和科技发展的法规性文件，并把“实验动物替代研究”列为“实验动物基础性研究”的重点内容［6］。2001年科学技术部发布的《科研条件建设“十五”发展纲要》中，明确提出“推动建立与国际接轨的动物福利保障制度”，并把这一工作纳入“全面推行实验动物法制化管理”的重要内容之一［7］。2006年我国发布《关于善待实验动物的指导性意见》，首次对实验动物福利提出指导性意见。我国也于2006年首先建立了中国替代方法研究评价中心（Chinese Center for Alternatives Research＆Evaluation，CCARE），旨在为中国的替代方法研究提供信息交流、法规介绍和技术服务的平台，并于2007年开通了中国替代方法研究评价中心共识平台（www.vitrotox.com），通过这个平台有效推动了“3R”原则的社会认知、推进替代方法的研究和技术进步、实现资源的共享和信息自由交流［8］。中国兽医药品监察所也已于2013年8月起开始实施对动物试验的动物福利伦理审查申请程序。

随着动物福利受到愈加广泛的关注，国内外关于动物试验替代方法的研究也越来越多，主要研究领域有：化学品的毒理性研究；药物和疫苗产品的研发、评价和质量控制；食品中化学物质遗传毒性、致癌性的监管评估；化妆品的安全评价［9］。

3R原则受到了普遍关注，加强动物试验替代方法研究也已成为生命科学工作者的共识。许多专家强调，实验动物及其相关研究是一项基础性强、高新技术密集的研究领域，其发展和应用程度已成为衡量一个国家或地区科学技术水平高低的重要标志之一，我国的科学研究、新医药开发等领域要走在世界前沿，就要重视和开展实验动物的研究，加强动物试验替代方法的研究［10］。

2 动物试验替代方法在兽用疫苗检验中的应用

疫苗接种是预防和控制传染病的重要武器，自人类发现疫苗的免疫作用至今，疫苗为人类和动物的健康做出了重要贡献。兽用疫苗可以预防动物免受许多传染性疾病的侵害，更重要的是，兽用疫苗通过对一些人畜共患病的防控，对人类健康的贡献也不可小觑，如兽用狂犬病疫苗。同时，兽用疫苗还是预防一些外来病的重要手段，如口蹄疫、新型流感病毒等［11］。合格的疫苗一定要满足安全性、有效性的基本要求，这就决定了疫苗必须经过安全检验和效力检验。然而，在兽用疫苗的质量评价中，尤其是在评价兽用疫苗免疫效力的各种方法中，基于免疫学原理的动物免疫攻毒法等动物试验法仍然是最令人信服的兽用疫苗免疫效力评价方法，即动物试验很大程度上在兽用疫苗的免疫评价中仍发挥着不可替代的作用。但对于兽用疫苗检验中所用动物种类多、数量大的情况，动物试验法检验疫苗效力存在很多问题，主要有：动物（尤其是一些大动物和特殊动物）供应不足；动物标准不完善，监管不到位，质量得不到保证；动物试验过于频繁，动物福利未得到有效关注［12］。

国内外一直在努力探索应用替代方法检验兽用疫苗的质量，也取得了许多成果。目前，对于活疫苗的效力检验已广泛应用了替代方法，也有一些灭活苗应用了替代方法进行检验，大大降低了疫苗检验的成本和效率。迄今为止，应用较多的替代方法主要有：实验动物替代法、血清学替代法和疫苗抗原定量法。

2.1 实验动物替代法 用于兽用疫苗检验的实验动物中，一些小型动物，如鸡、鼠、兔等的供应较为充足，且易于获得符合试验要求的动物。但一些较大的动物，如猪、马、牛、羊等，和一些特殊动物，如貂、狐等的供应较难满足试验需要，且往往需要实验人员到养殖场甚至是散养户去一一筛选符合试验要求的阴性动物。严格意义上，这样的动物其实已不能称之为实验动物。而且由于国家对一些重大动物疫病实行强制免疫政策，筛选符合某些要求的阴性动物较有难度，如猪蓝耳病抗体阴性猪。因此，很多疫苗在检验中寻找了小型动物与本动物之间的平行关系，并用小型动物替代本动物进行检验，以节约成本，降低难度，也响应了3R原则中的“减少”要求。如猪瘟兔化弱毒疫苗的效力检验，应用兔体定型热法进行，替代了用阴性猪进行的强毒攻击，在提高检验效率的同时，也减少了强毒污染带来的安全隐患。再如猪圆环病毒 2型灭活苗（SH株）的效力检验，应用小鼠免疫试验法，既替代了攻毒试验，也替代了猪的使用，解决了实际检验中圆环阴性猪筛选难的问题［13］。除此以外，鸡新城疫活疫苗、鸡痘活疫苗等采用鸡胚检验法替代鸡检法也是实验动物替代法的应用。虽然在兽药典中，很多应用了实验动物替代法进行效力检验的产品，本动物免疫攻毒法仍作为备选方法之一列出［14］，但在实际中已很少应用。

2.2 血清学替代法 对于许多灭活苗成品效力检验，由于经过灭活加之佐剂的干扰，很难像活疫苗那样用半数感染量等方法进行抗原滴度的测定，因此，许多灭活疫苗不得不使用本动物攻毒法检验效力。而攻毒法无法做到动物福利的要求，而且需要试验和饲养场所严格防护，并严格处理动物排泄物、尸体等，从各个环节防止病原污染环境带来安全隐患。因此，一些灭活苗产品采用了血清学方法作为替代方法，即用疫苗免疫动物后，采集免疫血清，测定其中的特异性抗体滴度，以滴度的高低作为衡量标准。该方法减少了病毒扩散的危险，消除了攻毒给动物带来的痛苦，还节省了时间。从疫苗监控上看，该方法还将攻毒试验的“定性”判定（死亡或出现临床症状），转向了“定量”判定，更加准确，还可以将血清样品冷冻保存，方便复检［15］。可见，血清学替代法体现了3R原则的“优化”要求。如鸡新城疫、减蛋综合征二联灭活疫苗，该疫苗中的两种抗原均用血清学方法，测定免疫鸡血清中的HI抗体效价来检验疫苗效力［14］。

2.3 疫苗抗原定量法 对于疫苗来说，无论活疫苗还是灭活疫苗，其效力的最终决定因素都是其中抗原的含量。在活疫苗的效力检验中，通过在体外对抗原进行定量来评价疫苗质量的方法，已经很大程度上替代了免疫攻毒法，常用的方法有：利用微量细胞培养，观察细胞病变（CPE），计算细胞培养物的半数组织培养物感染量（TCID50），如猪繁殖与呼吸综合征活疫苗；对于不致细胞病变的抗原，可利用免疫荧光技术，计算半数感染量（FAID50）；利用某些病毒可在细胞单层上形成蚀斑的特性，通过蚀斑计数计算疫苗的蚀斑形成单位数（PFU），如鸡马立克氏病活疫苗；对于有的细菌活疫苗，可通过活菌计数计算菌落形成单位数（CFU），如布氏杆菌病活疫苗［14］。这些试验常常用到Reed－Muench法或Karber法进行定量，并建立了与传统动物检验法的相关性，且在质量控制中通常保留一定的缓冲范围，以尽量减小检验误差和疫苗保存期间的效力损失，在美国，这一缓冲范围通常分别为100.7TCID50和100.5TCID50［16］。疫苗抗原定量法的优点是不言而喻的，它最大程度的摆脱了动物试验的束缚，大大节约了检验成本、缩短了试验时间、并避免了动物个体差异造成的误差，同时也完全实现了动物福利3R原则的“替代”要求。

然而，对于灭活苗的成品效力检验，以上方法就难以胜任了，只能在灭活前对其进行抗原定量。由于灭活苗经过灭活，其免疫效力可以说几乎完全由抗原含量决定，而不需要像活疫苗那样依赖抗原活性经过一个体内的增殖过程来体现效力。但受活性和佐剂的影响，对灭活苗进行准确的抗原定量仍有一定难度。但仍有一些灭活苗产品实现了抗原定量法评价效力，其中，ELISA方法应用最为普遍。如美国辉瑞公司生产的猪支原体肺炎灭活疫苗，将疫苗破乳处理后，将水相中的抗原稀释后包被反应板，采用ELISA方法测定疫苗中所含抗原的相对效力单位值［17］；美国勃林格殷格翰动物保健有限公司生产的猪圆环病毒2型杆状病毒活载体灭活疫苗，采用了新型水溶性佐剂，不需破乳处理即可直接利用ELISA方法测定相对效力值［18］。利用ELISA抗原定量方法评价灭活苗效力离不开参考疫苗的桥梁作用，即参考疫苗经过了本动物实验等传统方法检验，并与替代方法进行了平行关系分析，其效力值是特异性、免疫原性、抗原含量符合性和其免疫保护性等生物学特性综合反映的结果，在替代方法中，参考疫苗代表了传统方法，实现了效力检验的等效替代，根据被检疫苗与参考疫苗平行对比检验后，经计算而形成相关效力单位值（RF值），对被检疫苗的抗原含量、免疫抗体效价和保护效力是否符合法定质量标准予以评价和判定［19］。美国更是在其兽医局规章中规定了进行灭活兽用生物制品相关抗原含量测定的所有体外效力检验，均应采用有效期内的参考免疫原制备物来进行平行测定或其他能够证明在平行关系、特异性和重复性方面至少与平行测定等同的其他方法进行［20］。当然，ELISA并不是唯一适用灭活苗抗原定量的检验方法，如对口蹄疫灭活疫苗，我国农业部已于2014年初制定并发布了口蹄疫灭活疫苗内毒素和总蛋白测定法及相应标准，利用不同方法对疫苗进行破乳取得水相，测定其中内毒素含量，并采用Lowry法测定其总蛋白含量［21］。并且农业部发布了《关于做好口蹄疫疫苗质量标准提升工作的通知》，在提高口蹄疫灭活苗及合成肽苗的质量标准的同时，要求相关生产企业结合自身实际，尽快组织企业生产和质量检验人员，认真学习、准确理解新增检测参数，掌握检验技术［22］。该方法将逐步取代以牛为实验动物的PD50测定法，在节约成本、提高效率的同时，有利于国家对口蹄疫疫苗的监督管理，进而大大促进口蹄疫防控工作的开展。

在疫苗的抗原定量法检验疫苗效力的研究中，荧光定量PCR方法也受到了许多研究人员的关注。荧光定量PCR方法可对抗原的核酸特定片段进行快速定量检测，具有实时性、高灵敏度、高通量检测、高特异性等优点，并能够以核酸拷贝数的形式具体、准确、客观地显示抗原的含量。Marsha S Russell等利用荧光定量PCR方法评价了水痘弱毒活疫苗的效力，并与传统的蚀斑计数检验法进行了相关性分析，证明了两者之间没有显著差异，具有良好的相关性［23］。陈锴等也探索了利用荧光定量PCR方法作为猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验替代方法的可行性［24］。然而，该方法测得的病毒核酸载量不能直接反映其中正确组装的病毒粒子数量［20］，且无法区分病毒是否具有活性［25］，这些弱点限制了荧光定量PCR方法作为效力检验替代方法的应用。如何正确应用该方法测定疫苗的效力，还有待进一步研究。

3 结语

应用动物试验替代方法进行兽用疫苗检验已是许多研究人员的共识，是疫苗检验工作的必然发展趋势。但我国的动物试验替代方法研究相比国外发展缓慢，在兽用疫苗检验替代方法尤其是体外抗原测定法及参考品的研制和应用上相对滞后，不但一些已有的疫苗产品仍在使用传统方法检验，一些新研制的疫苗产品也是如此。有些研究人员在探索替代方法时仍存在一些误区，认为在检验疫苗效力时必须进行本动物攻毒试验。其实，建立动物试验替代方法的关键是要建立替代方法和传统方法的平行关系，在不同批次产品间进行重复确认，并应用统计学方法对两种方法的相关性进行分析，以保证实现两种方法的等效替代，进而真正建立起应用替代方法检验疫苗效力的质量标准。这就需要相关研究人员在研发、申报新产品时，除了改善生产工艺，研发新型疫苗，应用新型佐剂以外，要转变观念，勇于探索替代方法并进行严格验证；相关监督管理机构也可以通过建立新的指导原则和评价标准来对替代方法研究进行引导和鼓励。动物试验替代方法在疫苗检验中的普及，在节约检验成本、提高检验效率、保障动物福利的同时，也必将使疫苗的监督管理工作更细化、更及时，从而促进我国动物疫病防控工作的开展。

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［17］中华人民共和国农业部公告第1392号.猪支原体肺炎灭活疫苗（P－5722－3株）质量标准［Z］.

［18］中华人民共和国农业部公告第1465号.猪圆环病毒2型杆状病毒活载体灭活疫苗质量标准［Z］.

［19］United States Department of Agriculture Center for Veterinary Biologics Testing Protocol.SAM318.04.Supplemental assay method for estimating relative potency by the automated selection of line segments in RelPot 4.0 software［Z］.

［20］美国农业部兽医服务局规章第800.92号.按照联邦法规9CFR113.8对分发销售的产品批进行体外检验［Z］.

［21］中华人民共和国农业部公告第2078号.口蹄疫灭活疫苗内毒素和总蛋白测定法［Z］.

［22］农业部办公厅关于做好口蹄疫疫苗质量标准提升工作的通知［EB／OL］.（2013－06－13）.http：／／www.moa.gov.cn／zwllm／tzgg／tfw／201306／t20130613_3491208.htm.

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（编 辑：李文平）

Application of Alternatives to Animal Experiments in the Evaluation of Veterinary Vaccine

WANG Xiao－hui，LI Cui，JIANG Hui，ZHANG Xiu－ying，WEN Fang，LU Lian－shou，WANG Zai－shi∗
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing100081，China）

This review has introduced the alternatives to animal experiments and its development situation at home and abroad.Besides，this paper has provided an overview about the application，advantages and significance of alternatives to animal experiments from three aspects，including the improvement of animal use，the serological assay and the quantification of antigens in the vaccine，so as to offer benefit to the research of the alternatives to animal experiments in the evaluation of veterinary vaccine.

the alternatives to animal experiments；the evaluation of veterinary vaccine

2015－01－16

A

1002－1280（2015）04－0060－05

S859.79

948项目（2011－G14543）；“十二五”科技基础性工作专项重点项目（2013FY113300－3）

王晓卉，硕士研究生，从事兽药标准物质研究。

王在时。E－mail：wangzaishi＠ivdc.org.cn