Klotho蛋白与血管内皮关系研究进展

Klotho蛋白与血管内皮关系研究进展

林雅军胡刚魏洁

(卫生部北京医院卫生部北京老年医学研究所，北京100730)

关键词〔〕Klotho蛋白；衰老；血管内皮细胞

中图分类号〔〕R592〔文献标识码〕A〔

第一作者：林雅军(1976-)，男，博士，副研究员，主要从事细胞衰老研究。

血管内皮功能失调是诸多心血管疾病发生、发展的始动因子。冠心病患者及糖尿病患者血管内皮功能明显受损〔1，2〕。研究〔3〕发现Klotho(KL)基因缺陷小鼠的动脉发生类似人类动脉粥样硬化样病理变化及人类早衰样症状。本文探讨KL基因与血管内皮功能的关系及二者对老年相关疾病的影响。

1KL基因和蛋白的特征

KL是以希腊纺织生命线的女神命名的，是1997年Kuro-o〔4〕从一个基因突变小鼠发现的，此种小鼠表现出类似人类早衰综合征样的多种异常表型。人和小鼠KL基因定位于染色体13q12区域，大鼠则定位于染色体12q12区域。KL基因全长约50kb，包括5个外显子和4个内含子。在KL基因结构中存在一个潜在的可变剪切位点，这一位点如果接受了一个50bp片段的插入，该插入序列末尾的两个核苷酸TA就会与外显子4的第一个核苷酸G共同构成一个终止密码TAG，使得DNA由此截断形成一个短的开放阅读框，仅含有3个外显子，编码分泌型KL蛋白。但如果可变剪切位点没有50bp片段的插入，其将编码具有1 014个氨基酸的模型KL蛋白。人膜型KLcDNA全长3 036bp、分泌型cDNA全长1 647bp；小鼠和大鼠膜型KLcDNA长度相同为3 042bp，小鼠分泌型为1 650bp，而大鼠无分泌型。人与小鼠的KLcDNA有80%的同源、与大鼠有83%的同源〔5〕。

KL蛋白的细胞外区域由KL1和KL2两个同源区域构成。每一个区域与哺乳动物乳糖-皮根苷水解酶同源，与细菌和植物的β-糖苷酶同源〔2〕。其具有外切糖苷酶活性，能够水解糖类、糖蛋白和糖脂β-糖苷键。通过一个未知的酶切掉细胞外区域(带有或不带质膜区域)产生KL蛋白的分泌型，其存在血液、尿液和脑脊液。另外，如果在第三个外显子处发生切割会产生仅仅包含KL、而KL跨膜区和胞内区缺失的另一种分泌型的KL蛋白〔6〕。因此，KL基因至少产生3种蛋白：膜型和两个分泌型，也就是膜型KL蛋白脱落产生的整个胞外功能区，和由选择性剪切酶剪切形成的胞外功能区。

KL基因在有限的组织中表达，主要在肾脏远曲小管和脑脉络膜表达。在脑垂体、甲状旁腺、胰腺、睾丸、卵巢、胎盘、骨骼肌、膀胱、结肠和内耳中也表达〔5〕。在KL基因突变小鼠(转基因纯和小鼠)，KL基因表达受到抑制，表明在KL基因5′端进行的插入突变产生一个严重的下效等位基因〔4〕；并且通过常规基因靶向处理能够产生无效等位基因〔7〕。无效等位基因的纯合子(KL-/-)小鼠表现出与下效等位基因纯合子小鼠(KL突变小鼠)相同的衰老表型。KL-/-小鼠和KL基因突变小鼠在本文中通称为KL基因缺陷小鼠。

2KL基因缺陷小鼠血管内皮改变

KL基因缺陷小鼠能够正常生长到3w，并且在外形上与其同窝野生型小鼠没有显著差别。然而，从3w起直至其8～9w后死亡，其停止生长。尽管在发育过程中出现多种类似人类衰老的异常，但是至今没有发现其特殊的死因〔4〕。

KL基因缺陷的小鼠在出生4w后即可出现动脉硬化，并随增龄而加重，表现为主动脉严重钙化，肌性中动脉中层钙化、内膜增厚，肾脏小动脉严重钙化等，这些血管变化与人类动脉硬化非常相似。把外源性正常KLcDNA转导给KL基因缺陷小鼠后，其动脉硬化程度可得到显著改善〔8〕。

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和其抑制剂(PAI)-1是纤溶系统的主要成分，是纤溶系统关键性调节物质，在纤溶系统的活化过程中占有重要的地位。两者之间的动态平衡对维持正常的血液流动有着重要意义。两者失衡将导致出血或血栓形成。成小苗等〔9〕研究发现，与野生型小鼠相比，KL基因缺陷小鼠血浆活化PAI-1抗原和多种组织PAI-1mRNA水平显著提高。升高的PAI-1与年龄和异位钙化进展及肾脏肾小球纤维沉积相关。免疫组化检测发现PAI-1mRNA在肾小管内皮细胞，心肌细胞，肾上腺髓质细胞和Mönckeberg动脉粥样硬化血管平滑肌细胞和内皮细胞转录水平显著升高。

血管内皮作为循环血液与血管平滑肌之间的中介组织，除具有天然屏障作用外，还具有调节血管张力、参与血管腔内止血过程和调控血管平滑肌增殖的功能。这些功能是通过血管内皮细胞分泌的一系列血管活性物质实现的。一氧化氮(NO)为主要的舒张松弛因子，内皮素(ET)为主要的缩血管因子，这两类活性物质相互对立又相互联系，共同维持血管及血液内环境的平衡。Maekawa等〔10〕观察到KL基因缺陷小鼠依赖乙酰胆碱的主动脉舒张功能较野生型明显下降，证实了KL基因缺陷小鼠内皮源性NO较野生型生成减少，NO合成减少可能是KL基因缺陷小鼠易发生动脉硬化的原因。RT-PCR检测表明血管内皮细胞中无KL基因表达，推测KL基因维持血管内皮细胞分泌NO可能是通过其分泌型的KL蛋白或者由KL蛋白介导的循环因子来实现的。为验证这一推测，研究进行了KL基因缺陷小鼠与野生型的联体结合试验，在联体饲养2w后发现主动脉的舒张功能明显增强，4w后主动脉和提睾肌动脉的舒张功能趋于正常，与野生型无明显差异，进一步证实了KL蛋白作为循环因子与血管内皮细胞失调的相关性〔10，11〕。在随后的研究中以存在多种动脉硬化危险因素的自发性2型糖尿病(OLETF)大鼠为研究对象，经腺病毒将KL基因导入OLETF大鼠后可改善内皮细胞功能，增加内皮细胞的NO合成，同时还具有减轻血管周围组织纤维化、逆转血管重构、降低血压的作用，而这些对减轻动脉硬化都有重要作用。以上研究均表明KL基因与内皮功能失调、NO合成及动脉硬化存在因果关系。鉴于KL基因在动脉硬化发病中的重要作用，补充KL蛋白或者针对KL基因的治疗可能在改善动脉硬化方面有益。

Fletcher等〔12〕研究发现成纤维细胞生长因子(FGF)-21治疗OLETF大鼠10w后，血管内皮细胞NO合成增加，肾脏KL基因的表达上调，血糖、血压、血脂等代谢紊乱得到改善，分析原因可能与肾脏具有丰富的KL基因表达和曲格列酮治疗可减轻肾脏损害有关，但是否直接通过上调KL基因表达而出现上述作用还不明确。Masuda等〔13〕在基因补救治疗方面做了进一步研究，他们在KL基因缺陷小鼠中导入了可被锌诱导的KL基因表达系统，该系统融合了一个金属硫蛋白-1启动子的外源性KL基因，可在锌诱导下表达KL基因。研究发现，经过锌水饲养后KL基因缺陷小鼠的动脉粥样硬化损伤可逐渐减轻，经过11w后原损伤可完全消失，以上实验证明了基因补救治疗的有效性。

3KL蛋白对内皮细胞保护作用的机制

KL蛋白主要参与体内钙磷代谢，维持体内钙磷平衡，此外，其还参与胰岛素抗性过程和对活性氧物质的抗性等〔14〕，而其对血管内皮的功能主要包括以下方面：

3.1抗炎KL蛋白能够抑制由肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)黏附分子(ICAM)-1和血管细胞黏附分子(VCAM)-1的表达及核因子(NF)-κB活性和人NF-κB抑制蛋白(IKB)磷酸化。而且KL蛋白能够逆转TNF引起的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化抑制。KL蛋白能够抑制单核细胞黏附于HUVEC，在大鼠主动脉器官培养中抑制黏附分子表达〔15〕。

3.2抗氧化KL蛋白能够通过激活环磷酸腺苷(cAMP)信号通路和促进NO生成来增加锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的表达，同时发现KL蛋白能够抑制血管紧张素Ⅱ诱导的HUVEC中活性氧(ROS)生成〔16〕。另有报道KL蛋白能够通过CAMP-蛋白激酶A(cAMP-PKA)信号通路增加血管紧张素Ⅰ转换酶活性〔17〕。

3.3抗凋亡研究发现KL蛋白过度表达能够减少过氧化氢(H2O2)诱发的SV40转化的非洲绿猴骨细胞(COS)-1和Jurkat细胞凋亡，能够减少H2O2和依托泊苷诱导的HUVEC凋亡。通过SA-β-gal染色发现KL蛋白能够干预H2O2诱发的细胞早衰。证实经重组KL蛋白处理人脐静脉内皮细胞后，其Caspase-3和Caspase-9的活性明显下降，而p53和p21表达也下调，提示KL蛋白有抗衰老和细胞凋亡的作用。由于内皮细胞衰老和凋亡是动脉硬化的重要环节，可见KL基因还可通过抑制内皮细胞衰老和凋亡而防止动脉硬化〔18〕。Carracedo等〔19〕曾也在内皮细胞中观察到KL蛋白有抗凋亡和氧化应激的作用。

3.4促进血管生成对单侧下肢缺血的KL基因缺陷小鼠模型进行激光多普勒血流分析表明，KL基因缺陷小鼠缺血与正常的激光多普勒血流比例减少。主动脉环培养分析表明KL基因缺陷小鼠血管生成受损，并伴随内皮来源的NO释放减少。而且与野生型小鼠比较，移植同源骨髓细胞掺入缺血组织毛细血管的比率降低，伴随骨髓和外周血中c-kit+CD31+内皮祖细胞(EPC)样的单核细胞减少。3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂——西立伐他汀和匹伐他汀能够恢复KL基因缺陷小鼠新生血管的损伤，伴随骨髓和外周血中c-kit+CD31+细胞增加，并且增加主动脉环培养中的血管生成〔20，21〕。

研究表明人类KL基因多个单核苷酸多态性(SNP)位点与动脉硬化性疾病相关，如KL基因C1818T多态性CT基因型与老年人特别是老年男性的急性冠脉综合征发病存在相关性〔22〕；KL基因395A等位基因与动脉硬化呈负相关；对79岁以上的人群研究发现，KL-VS等位基因杂合子的5年生存率较高，提示杂合子更具有长寿优势。同时发现高密度脂蛋白胆固醇和收缩压同KL-VS基因型有关，杂合子发生脑卒中的风险性较低，纯合子发生脑卒中的风险性最高。总之，KL蛋白能够通过抗炎、抗氧化、抗凋亡和促进血管生成等方面作用保护血管内皮免受有害因子的损伤，预防动脉粥样硬化的发生，有望减少老年人心脑血管疾病的发生率和病死率。

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〔2013-12-17修回〕

(编辑杜娟)