川芎嗪在脑缺血再灌注损伤中的保护作用

川芎嗪在脑缺血再灌注损伤中的保护作用

高海军白焕焕1雷廷黄海燕牟青春2

(吉林大学第一临床医院神经肿瘤外科，吉林长春130021)

关键词〔〕川芎嗪；脑缺血再灌注损伤

中图分类号〔〕R743〔文献标识码〕A〔

通讯作者：牟青春(1980-)，男，主治医师，讲师，在读博士，主要从事缺血损伤后神经再生研究。

1吉林大学第一临床医院胃肠内科

2牡丹江医学院红旗医院神经外科

第一作者：高海军(1987-)，男，在读硕士，主要从事颅脑相关肿瘤研究。

川芎嗪(AMP)又名天然四甲基吡嗪,为中药川芎的主要有效成分,传统用于活血行气祛瘀〔1，2〕。TMP对缺血性脑疾病的治疗效果已经在临床实验中得到验证〔3〕。其作用机制比较复杂，尤其在脑缺血引起的缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制方面。本文对TMP在脑缺血再灌注损伤中的保护作用机制及给药方式进行综述，为缺血性脑疾病的临床治疗中提供更有价值的资料。

1抑制兴奋性氨基酸释放

谷氨酸(GLu)中枢神经系统作用最强、含量最高、分布最广的兴奋性神经递质〔4〕。当神经末梢处去极化后，突触囊泡内的兴奋性氨基酸被释放到突触间隙，与突触后膜上的特异性受体结合完成特定的生理功能。据Takano等〔5〕报道当机体处脑缺血损伤时，大量的GLu被释放到细胞外，引起急性神经细胞变性。

GLu受体分为两类：一类为离子型受体，即N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)、海人藻酸受体(KAR)和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑受体(AMPAR)；另一类为代谢型受体(mGluRs)，与膜内G-蛋白耦联，通过G-蛋白效应酶、第二信使等信号转导系统发挥作用，产生较缓慢的生理作用。电压依赖性Ca2+通道和代谢型GLu受体在介导兴奋性毒性对神经元损伤中发挥重要作用。

脑缺血后引起突触末梢谷Glu释放，激活突触后膜亲离子受体(NMDA受体、KA受体、AMPA受体)，导致膜去极化,膜兴奋性增高，阳离子通道开放,引起Ca2+大量内流,导致细胞内Ca2+超载，启动一系列酶引起细胞损伤，其中活化的一氧化氮合酶(NOS)可催化产生过量NO,与超氧阴离子形成过氧亚硝酸根离子和羟基,损伤线粒体膜,使线粒体形成漏洞,开放线粒体转换孔,致使离子平衡紊乱〔6〕。

(TMP与离子型受体方面)Fu等〔7〕通过实验证实TMP可通过抑制GLu生物合成和分泌,增强GLu摄取，进而抑制Ca2+大量内流导致的Ca2+超载，降低GLu兴奋性毒性对神经元的损伤。研究表明,红藻氨酸诱导引起的缓慢神经毒性不同于GLu、门冬氨酸对神经元的直接性细胞毒性效应〔8〕。Shih等〔9〕通过实验证实TMP对海人藻酸诱导的海马神经元兴奋性毒性具有保护性作用，通过调节海人藻酸对海人藻酸受体的亲和力和海人藻酸受体的数量，阻断细胞外Ca2+内流和细胞储备钙离子的释放，维持线粒体膜电位，减少自由基的生成，增加对细胞内生成的自由基的清除率，经上述方式对海马神经元起保护性作用。

(TMP与代谢型受体方面)Glu通过激活代谢型Glu受体引起细胞通透性改变,使大量Na+和Cl-进入细胞内 ,水被动进入细胞内引起细胞水肿,引起细胞坏死和凋亡〔10〕。但代谢型受体易受细胞类型、代谢环境影响，加之缺乏特异性受体拮抗剂 ,导致TMP在该方面研究缺乏特异性检测指标，同时代谢性受体易受实验环境、人为因素所影响使实验出现假阳性结果，因此TMP目前基于在代谢型Glu受体方面的研究较少，将是今后的研究方向及重点。

2促进内源性神经干细胞的迁移、分化及增殖

研究表明脑缺血可诱导内源性神经干细胞向缺血病灶区迁移，分化为神经元细胞，增殖取代缺血灶中的坏死细胞，是参与脑缺血后神经元再生的重要环节，被认为是机体的一种代偿性、适应性反应，有利于脑缺血后神经功能恢复。

内源性神经干细胞在成人脑组织主要存在于海马齿状回颗粒细胞层下区(SGZ)和室管膜下区(SVZ)〔11〕。脑缺血引起海马齿状回SGZ和SVZ的内源性神经干细胞活化，并促进其增殖，随后增殖的神经干细胞迁移至缺血病灶区，如嗅球、大脑皮质、海马齿状回、纹状体等，最终活化、增殖、迁移的神经干细胞分化为特定区域的神经元细胞，发挥特定的神经功能〔12〕。

Tanaka等〔12〕运用成年沙豚鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型显示，脑缺血后海马齿状回早期新生的神经干细胞最初主要位于SGZ，30d后新生的神经干细胞迁移至颗粒细胞层，表达成熟的神经元标志物，并具有和正常颗粒细胞相同的功能。Nakatomi等〔13〕采用MCAO模型， 以5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记缺血后室管膜下区新生的神经干细胞，结果示缺血14d后，纹状体或皮质梗死区周围出现BrdU标记细胞，证实室管膜下区的神经干细胞迁移至纹状体或皮质梗死区。Iwai等〔14〕采用多唾液酸神经细胞黏附因子标记处迁移状态的神经干细胞，通过实验证实脑缺血后室管膜下区新生神经干细胞沿嘴侧迁移流向嗅球迁移，60d后大部分新生神经干细胞迁移至嗅球，并分化为成熟的神经元细胞。

因此通过调控内源性神经干细胞的迁移、分化、增殖可以增加大脑的可塑性、改善脑缺血后神经功能恢复治疗方面的效果。Xiao等〔11〕通过构建大鼠MCAO模型，采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测梗死面积及免疫组织化学法检测细胞增殖和分化，显示TMP可通过抑制神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的合成，促进海马齿状回SGZ和室管膜下区(SVZ)神经干细胞增殖与分化，对脑缺血再灌注损伤起到保护性作用。

TMP可通过刺激脑源性神经营养因子(BDNF)和成纤维细胞生长因子(bFGF)表达促进神经元再生。陈懿等〔15〕通过动物实验示TMP通过上调血管内皮生长因子(VEGF)、BDNF、bFGF的表达，改善脑缺血病灶微环境，促进内源性神经干细胞迁移。同时发现神经导向因子Slit、细胞外基质分泌蛋白Reelin蛋白等也在参与调节神经干细胞迁移方面发挥重要作用〔16〕。辜建伟等〔17〕局灶性大脑中动脉梗塞模型发现缺血后Slit2 表达增加，7d左右达到高峰，持续30d后逐渐降低，显示Slit2通过Robo2-RhoA通路以一种排斥导向的方式促进SVZ产生的神经干细胞，沿吻侧迁移流纵向迁移到嗅球，同时还有一部分沿胼胝体横向到脑组织侧面的皮质和纹状体等部位对缺血后神经元起到保护性作用。Courtes等〔18〕通过溶血磷脂诱导局灶性胼胝体脱髓鞘和单侧皮层缺血模型发现：Reelin在缺血灶上调，促进神经前体细胞/神经干细胞经室管膜下区-吻侧迁移流-嗅球迁移途径向缺血灶迁移，对缺血后神经功能恢复起到保护性作用。但目前TMP基于脑缺血后Slit及Reelin的研究报道及作用机制尚不清楚， 鉴于TMP对脑缺后神经干细胞作用的明确性，关于TMP在脑缺血后Slit、Reelin的深入研究具有必要性和临床指导性。

3促进脑缺血后脑血管再生

最新研究表明促进缺血区血管内皮细胞再生，成为促进新生血管形成，尽快恢复缺血灶血供 ,挽救濒死的神经元及神经胶质细胞，促进脑缺血后神经功能恢复的关键。

缺血后血管再生是一个复杂过程，受血管内皮系统(ECS)、血管外基质、蛋白水解酶系统、促血管再生因子及血流剪切力等多种因素所影响，其中促血管再生因子所参与的信号转导对于内皮系统、血管的再生起决定性作用。据研究，现发现的促血管再生因子有20余种,如VEGF、血管生成素(Ang)等。Shen等〔19〕采用免疫组化双标记法，在MCAO模型基础上采用转基因技术可控性表达VEGF，结果显示通过可控性表达VEGF发现在半暗区有较多新生血管产生，充分说明VEGF对于缺血后脑组织血管修复的重要性作用。

Zhang等〔16〕采用鼠的微血管细胞系bEnd.3细胞示：TMP在低浓度时通过Fas-FasL途径促进VEGF的表达，进而促进血管再生。虽然实验显示VEGF及其受体结合在脑缺血发生后被活化,发挥促血管再生、增加血管通透性的作用,使内皮细胞增生并诱导新生血管形成，进一步改善缺血脑组织血液供应，然而VEGF在增加血管通透性的同时可能会加重局部脑水肿，加剧缺血区的脑组织坏死。因此,近些年针对上述问题通过研究发现Ang家族在均衡血管再生与渗透性方面具有重要意义。Ang-1与其Tie-2受体结合在血管再生发挥重要作用，主要作用于血管再生后期 ,通过拮抗内皮细胞凋亡、促使内皮细胞出芽和分支，募集周围支持细胞，促进完整的血管壁形成〔20,21〕,进而减轻VEGF引起的血管通透性增加、血脑屏障渗漏现象〔22〕。因此，Ang-1/Tie-2系统和VEGF/VEGF受体系统在脑缺血再灌注损伤后的新生血管生成中发挥协同、补充作用。上述表明TMP可通过VEGF对脑缺血后血管生成发挥作用，然而TMP对于VEGF引起的血管通透性增加导致血脑屏障渗漏现象尚无相关研究，而血脑屏障通透性增加会加重局部脑水肿，加剧或延缓缺血后神经能的恢复，Ang可以拮抗血管通透性增加所引起的脑水肿，因此阐明在脑缺血损伤时TMP与Ang相互关系及作用机制对于充分了解TMP在脑缺血后血管生成方面的作用是非常必要的，这将为今后的实验研究提供一种新的思路，以便进一步全面探讨TMP在血管生成方面的作用，为临床提供更有价值的资料。

4抑制血小板聚集进而抗血栓形成

脑缺血后,机体血液处于高凝状态 ,有利于血小板血栓的形成 ,而血栓的形成则直接参与了脑缺血的发生与发展〔23〕。Okada等〔24〕通过构建MCAO模型证实局灶性脑缺血后血小板被活化，血小板活化在缺血后的自然病程中起关键性作用，血栓的形成是造成继发性脑损伤的重要原因之一，因此通过抑制血小板聚集进而抑制血栓形成，可以对缺血后脑损伤起到一定的保护性作用。

整合素家族黏附受体血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa复合物是血小板上含量最丰富的膜糖蛋白,参与血小板聚集和血栓形成。脑缺血后诱导血小板激化后，各种黏附蛋白，(包括纤维蛋白原、血管性假性血友病因子(vWF)、纤维连接蛋白和玻连蛋白)、各种诱导剂 (如凝血酶、胶原、血栓素A2等)与血小板上相应受体结合 ,引起GPⅡb/Ⅲa立体构型发生改变,进而促进血小板活化、聚集和释放反应。GPⅡb/Ⅲa成为活化血小板的分子标志物〔25〕。Sheu等〔26〕通过实验证实TMP抑制血小板聚集和释放ATP存在剂量依赖性，TMP在较低浓度时通过抑制细胞内储存Ca2+的释放，进而抑制ATP的释放以及磷酸肌醇裂解和血栓素A2形成;在较高浓度,通过抑制GPⅡb/Ⅲa复合物与黏附蛋白结合，对血小板的聚集起到抑制作用。

GPIb/IX复合物是血小板膜上又一重要的糖蛋白，主要识别血管中的血管性血友病因子(vWF)因子。vWF与血小板GPIb/Ⅸ的结合后，引起细胞内Ca2+升高，进一步促进GPⅡb/Ⅲa活化，成为vWF的受体并与之相连，通过vWF形成牢固的血小板间聚集态〔27〕。GPIb与vWF连接充当活化作用，而GPⅡb/Ⅲa与vWF连接是形成稳定的血小板聚集所必须的〔28〕。Li等〔29〕提示TMP在10 800/s相对较高的剪切时抑制vWF与GPⅠbα和GPⅡb/Ⅲa结合，起到抑制血小板聚集的作用。

关于TMP脑缺血后体内实验尚缺乏相关报道，且TMP对血小板激活、缺血引起的血小板释放反应的研究尚不清楚，如果能阐明TMP在该方面的作用及相关机制，这将对TMP在临床多学科应用提供更具价值参考。

5抑制炎症因子释放进而抑制炎症反应

炎症反应是造成脑缺血后脑组织持续性损伤的重要原因之一,尤其在脑缺血再灌时更为显著，因此通过控制缺血后引起的一系列瀑布式级联炎症反应是减轻脑缺血再灌注损伤的重要策略之一。

脑缺血后 ,小胶质细胞、星形胶质细胞迅速被激活,活化、增生的小胶质细胞、星形胶质细胞释放出大量的促炎症介质和神经毒性分子 ,参与脑缺血损伤诱导的炎症反应，这些大量产生的炎症介质能反过来进一步刺激小胶质细胞、星形胶质细胞的活化、增生 ,从而加剧炎症反应 ,形成一个恶性循环。Liao等〔3〕表明TMP可以明显抑制小胶质细胞、星形胶质细胞及其他炎症细胞的活化、向缺血灶的迁移、聚集，进而对脑缺血再灌注损伤起到保护性作用。

多年的实验示TMP在抑制炎症介质所介导的炎症反应具有明显的保护性作用。Chang等〔30〕通过MCAO模型显示TMP可以抑制脑缺血后炎症因子HIF-1α、肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达，进而抑制细胞凋亡，对神经元起到一定的保护性作用。Liu等〔31〕证实TMP可以抑制脂多糖(LPS)诱导N9胶质细胞炎症因子NO、诱导型NOS(iNOS)的产生，通过抑制核转绿因子(NF-κB)活化、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Akt磷酸化、抑制细胞内活性氧(ROS)的形成起到一定的保护性作用。TMP还可以通过可抑制核因子-кB的活化，下调TNF-α和ICAM-1表达，从而减轻脑缺血再灌注后炎症反应，发挥脑保护作用〔32〕。

ICAM-1和环氧合酶(COX)-2为TMP在缺血再灌注损伤治疗方面的又一靶点。Xu等〔33〕通过TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)证实，TMP可以显著抑制细胞黏附分子-1(ICAM-1)的表达，进而对内皮细胞起到保护性作用。Liao等〔3〕证实TMP可以减少脑缺血后COX-2及其代谢产物PGE2，进而发挥保护性作用。

TMP在脑缺血后抑制炎症细胞向缺血区域迁移和炎症因子的表达方面发挥出显著的作用，但TMP是否可通过IL-6、ICAM-1和COX-2等炎症因子在脑缺血再灌注损伤中发挥抗炎作用，或者TMP和这些炎症因子是否具有直接相关性尚无相关报道，这可以作为今后研究提供新的研究指导。

6抑制细胞凋亡

研究显示细胞凋亡与脑缺血再灌注损伤有密切的联系,通过抑制细胞凋亡可以减轻脑缺血损伤的程度，进而对脑组织起到保护性作用，因此近些年来对TMP在抑制细胞凋亡方面的研究已经成为热点,TMP在抑制细胞凋亡方面可以作用于许多靶点，如减缓线粒体膜电位的降低、减轻线粒体损伤〔33〕，抑制Ca2+内流〔34〕、抑制活性氧ROS〔35〕及iNOS、NO的产生〔36〕，抑制细胞凋亡程序中的关键酶Caspase家族表达〔34〕，抑制促进细胞凋亡蛋白Bax、促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达〔34～36〕，抑制TUNEL阳性神经元细胞数目〔34〕，进而对神经元起到保护性作用。以上研究表明TMP可以抑制脑缺血所诱发的细胞凋亡，但是基于TMP在线粒体膜电位方面的研究尚少，这将会是今后的研究重点，以便进一步深入研究TMP在脑缺血后抗细胞凋亡的作用机制。

7给药方式

MCAO模型依靠其优点，成为了研究脑缺血再灌注损伤最常用的模型，近年来AMP对脑缺后疾病的保护性作用已经逐渐被人们所了解，但鉴于其特殊的物理特性，选择恰当的给药方式对于其临床、实验研究是非常必要的。蔡伟等〔37〕予以6名健康志愿者口服AMP胶囊(174.5mg)采用高效液相色谱法对其药理学进行分析，示TMP可被迅速吸收并分布于机体，但会以相当快的速度清除，生物利用度低，因此口服给药对于AMP生物学作用研究不是很理想。Tsai等〔38〕通过S-D大鼠静脉给药(10mg/kg)，采用高效液相色谱-红外线法检测血药浓度示：血药浓度10～20min后达到高峰，但是迅速进行消除，给药后120分钟后，TMP几乎检测不到，这对于AMP的长期研究不利，因此静脉给药不适合于实验研究。腹腔注射〔3〕因其操作方便，腹膜面积大，密布血管和淋巴管,吸收能力特强,且腹腔补液时间短,速度快，对心脏负荷小，成为研究AMP对SD大鼠脑缺血后保护作用的理想给药方式。近年来，通过微量渗析法研究经皮给药〔39〕后和及经鼻腔给药〔40〕后AMP的药代动力学成为了热点，这对于临床给药途径提供了一种新的全新的方法。

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〔2015-01-19修回〕

(编辑袁左鸣)