食源性致病菌疫苗研究进展①

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.025

·专题综述·

食源性致病菌疫苗研究进展①

曾海娟宋春美吴淑燕杨标李建武邱实刘箐

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093)

中图分类号Q939.91

文献标志码码A

文章编号号1000-484X(2015)11-1553-04

①本文受国家质检总局科技项目(GSCIQ_2010IK220)、国家自然科学基金项目(31371776)和上海市科委高校能力建设项目(13430502400)资助。

作者简介：曾海娟(1990年-)，女，博士，主要从事食源性致病菌快速检测技术研究，E-mail:zenghaijuan12@126.com。

通讯作者及指导教师：刘箐(1970年-)，男，博士，教授，主要从事食源性致病菌致病机理及快速检测技术研究，E-mail:liuq@usst.edu.cn。

食源性致病菌是可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌。致病性细菌直接或间接污染食品及水源，人经口感染可导致肠道传染病的发生、食物中毒，及畜禽传染病的流行。常见的食源性致病菌主要有大肠杆菌(Escherichiacoli)、沙门氏菌(Salmonella)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyt-icus)、志贺氏菌(Shigella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、李斯特菌(Listeriamonocyt-ogenes)等。食源性致病菌是引起食品安全问题的重要来源。在一般情况下，食源性致病菌常引起急性中毒，轻者多以急性胃肠炎症状出现，如呕吐、恶心、腹泻等，较重者可出现呼吸、神经系统等症状[1]。

疫苗含有刺激免疫系统的抗原成分，可诱导机体产生抗体并产生记忆性B淋巴细胞，保护机体免受入侵病原体的感染。目前对食源性致病菌的防治主要依赖抗生素，抗生素的使用导致微生物产生耐药性，并可能使食品存在药物残留。研究发现，金黄色葡萄球菌对红霉素的耐药率达33.3%，副溶血性弧菌对四环素和复方磺胺甲恶唑耐药率分别为2.1%和3.2%，沙门菌对萘啶酸的耐药率为50%[2]。研发高效疫苗，通过免疫途径提高动物自身免疫力，降低抗生素的使用量，是预防食源性致病菌的有效方法之一。

我国在食源性致病菌传统疫苗的灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗的制备上已经取得了一些科研成果，截止到2014年9月19日，山东滨州华宏生物制品有限公司研制的鸡大肠杆菌病蜂胶灭活疫苗通过注册，中国兽医药品监管所与山东滨州华宏生物制品有限公司研制的鸭传染性浆膜炎、大肠杆菌病二联灭活疫苗通过注册。对于基因工程菌，中国科学院上海生物工程中心研制的仔猪大肠埃希菌K88、K99双价基因工程灭活疫苗，宁夏大学研制的犊牛、羔羊大肠埃希菌、B型产气荚膜梭菌基因工程灭活疫苗相继通过了注册，军事科学院生物工程研究所研制的仔猪大肠埃希菌病K88、LTB双价基因工程活疫苗也通过注册[3,4]。对于国外，美国辉瑞公司林肯厂研制的仔猪C型产气荚膜梭菌病、大肠杆菌病二联灭活疫苗通过注册，德国罗曼动物保健有限公司研制的鸡肠炎沙门氏菌病活疫苗也通过注册。近几年，食源性致病菌新型疫苗的基因工程亚单位疫苗以及核酸疫苗，都具有较好的免疫效果，但仍处于试验阶段，尚无商品化的疫苗投放市场。本文主要对食源性致病菌的传统疫苗和新型疫苗的研究进展及优缺点做了详细的综述。

1传统疫苗

传统疫苗即采用病原微生物及其代谢产物，经过人工减毒、脱毒、灭活等方法制成的疫苗，与新型疫苗相对。食源性致病菌的传统疫苗主要有灭活疫苗、减毒疫苗和亚单位疫苗。

1.1灭活疫苗灭活疫苗主要是采用热灭活或甲醛灭活制成的疫苗，该疫苗较为安全，具有保护性好，易于贮存运输的优点。灭活疫苗，由于含有病原体的蛋白或多糖等成分，可通过抗原或佐剂激活途径使机体对病原体产生获得性免疫应答[5]。灭活疫苗主要启动体液免疫作用，其体液免疫作用很强，能产生足够的抗体，且抗体在机体的维持时间较长。

刘富来等[6]制备肠炎沙门氏菌灭活苗，得出高温最佳灭活条件为60℃、30 min或50℃、120 min；得出甲醛最佳灭活条件为0.2%的甲醛溶液，37℃灭活24 h。以所制备的灭活疫苗免疫小鼠后，获得了100%免疫保护率，表明该灭活疫苗制备成功，且是安全有效的。周宸等[7]制备副溶血弧菌灭活苗，以云芝多糖和该灭活苗免疫斜带石斑鱼，可获得87.6%的免疫保护率。Yousif等[8]采用热灭活方式制备出血性大肠杆菌疫苗并免疫小鼠，攻毒后显示出100%保护率。Barman等[9]对6种不同血清型的志贺氏菌进行热灭活制备混合灭活疫苗，该灭活疫苗经口服免疫豚鼠，24 h后显示，免疫组中95.8%的豚鼠未出现痢疾症状，而对照组全部出现出血性痢疾或痢疾症状。可见，灭活疫苗的免疫原性良好，且免疫后可得较高的保护率。

1.2减毒疫苗减毒疫苗相对于灭活疫苗，其免疫力较强、作用时间较长。减毒疫苗模拟病原体自然感染的途径激活Toll样受体(TLRs)，诱导产生与病原体感染类似的免疫应答[10]，可启动细胞免疫和体液免疫作用，其免疫作用比较全面，且刺激机体产生抗体所需时间较短，但主要以细胞免疫作用为主，诱发的体液免疫作用较弱，产生的抗体水平较低，维持时间较短。

潘志明等[11]采用减毒鸡沙门氏菌疫苗免疫肉鸡，显示出的免疫保护率≥80%，而对照组100%死亡。孙洋等[12]构建了O157:H7的ler/stx双基因缺失突变的弱毒疫苗株，以该突变株O157:H7免疫昆明鼠母鼠，所产乳鼠授乳一周后，用O157:H7强毒株攻毒，保护率达81.03%。殷月兰等[13]构建了单核细胞李斯特菌actA/plcB双基因缺失的减毒疫苗株，采用该缺失株免疫小鼠，野生型李斯特菌株攻毒后显示出100%的免疫保护率，表明该疫苗安全性好，免疫保护力强。

1.3亚单位疫苗亚单位疫苗是利用微生物表面的一种或几种主要抗原成分制成的疫苗，如细菌的外膜蛋白、脂多糖(LPS)、外毒素、胞外蛋白酶等。此类疫苗只含有特异性的保护性抗原，主要诱导产生体液免疫应答，因而毒性低，安全性好，接种后不引起过敏反应或其他副作用。

Satoshi等[14]用PCR方法对EHEC O157的志贺毒素1(Stx1)进行定点突变，突变毒素无Vero细胞毒性，以该突变毒素免疫小鼠后能够抵抗100倍LD50野生型Stx1的攻击。Ursula等[15]对大肠杆菌的AB5型志贺毒素的A亚单位进行定点突变(丝氨酸272突变为丙氨酸)，突变的A亚单位失去毒性。该毒素纯化后免疫小鼠，攻毒后显示，小鼠获得80%的免疫保护率，而对照组全部死亡。

2新型疫苗

新型疫苗是采用生物化学合成技术、人工变异技术、分子微生物学技术、基因工程技术等现代生物技术制造出的疫苗，是近年来新发展的疫苗，其有别于传统常规疫苗。目前报道的可用于食源性致病菌的新型疫苗主要有基因工程亚单位疫苗和核酸疫苗。

2.1基因工程亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗是将选定的免疫原或抗原决定簇的编码基因，通过基因重组技术引入受体细胞内进行表达，并以表达产物纯化后制备的疫苗。此类疫苗是基因工程疫苗中最具安全性和稳定性的，且具有接种剂量小、免疫原性强的优点。基因工程亚单位疫苗主要诱导产生体液免疫应答。

2.1.1单价基因工程亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗的单价疫苗是选取致病菌的某个保护性抗原基因表达并纯化后制备的疫苗。

王洪斌等[16]克隆并表达了副溶血性弧菌的溶血素基因，对融合蛋白TDH进行纯化并脱毒后，免疫真鲷并攻毒，该疫苗对真鲷保护率达50%。Zhang等[17]选取沙门氏菌致病重要的入侵基因invH制备融合蛋白，攻毒后显示，保护率均在60%以上，与对照组相比差异均极显著。在此基础上构建C3d分子佐剂核酸疫苗，可显著提高小鼠体内的抗体水平，表明C3d是一种安全有效的分子佐剂。Gao等[18]采用基因工程的方法制备EHEC O157:H7的志贺毒素(STXS)的融合蛋白，免疫小鼠后，在50倍LD50攻毒中显示70%的免疫保护率。

2.1.2多价基因工程亚单位疫苗该疫苗通过将不同的抗原基因联到同一载体上，制成多联或多价疫苗，使免疫程序简化，使生产成本降低。

易勇等[19]采用基因工程方法表达了EHEC O157:H7的intimin C300及Stx2B的融合蛋白，融合蛋白及O157:H7全菌抗原的保护率分别为65%和60%。Wen等[20]利用基因工程脱毒方法表达获得EHEC O157:H7的Stx1和Stx2的类毒素，纯化后免疫小鼠产生了针对同型毒素的中和抗体，同时能够起到抵抗毒素攻击的作用。Mao等[21]选取副溶血弧菌的两种外膜蛋白pvuA和psuA的基因进行融合，表达的重组蛋白纯化后免疫大黄鱼，获得了75%的免疫保护率。Gu等[22]制备大肠杆菌EspA、Stx2及intimin C300三价重组蛋白，免疫小鼠并攻毒后显示出93.3%的免疫保护率。张雪寒等[23]构建并表达了含EHEC O157:H7的stxlb及tir基因的重组蛋白，可获得60%免疫保护率。郑磊等[24]制备副溶血弧菌高纯度融合蛋白FlaA-OmpK，可获得80%的免疫保护率。

2.2核酸疫苗核酸疫苗是指将重组表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在宿主细胞内表达，产生的抗原蛋白一部分诱发CD8+细胞毒性T细胞应答的产生，一部分引起CIN+T细胞反应，引发体液免疫应答，一部分呈递给B细胞，产生特异性抗体，诱发体液免疫[25]。核酸疫苗既有减毒疫苗的优点又无逆转的危险，可维持长时间的免疫反应，同时也便于构建多价疫苗[26]，因此也受到越来越多的重视。核酸疫苗中抗原基因的选取与能否产生良好免疫力密切相关，因而往往选择与致病直接相关的毒理基因构建而成。

2.2.1单价核酸疫苗Liu等[27]从副溶血弧菌基因组中克隆了vps基因并表达后，采用PCR方法使丝氨酸蛋白酶突变失活，将突变基因vps(Ser318-Pro)构建DNA疫苗，该疫苗最高可获得96.1%的免疫保护率。Li等[28]选取副溶血弧菌的ompK基因制备DNA口服微胶囊疫苗，免疫的黑鲷并攻毒后的免疫保护率为72.3%。

2.2.2多价核酸疫苗Ren等[29]采用基因工程方法获得大肠杆菌O139的两个主要毒理因子fedF和stx2e，制备DNA疫苗，该疫苗可提供100%的免疫保护率。

2.2.3二联核酸疫苗刘瑞等[30,31]构建含哈维氏弧菌oppA基因和副溶血弧菌的tdh2基因的二联DNA疫苗，对副溶血弧菌该疫苗可提供100%的保护率；对哈维氏弧菌该疫苗可提供60%的保护率。将鳗弧菌外膜蛋白基因ompU和副溶血弧菌的tdh2基因进行融合，该DNA疫苗对副溶血弧菌感染的保护率为100%；对鳗弧菌该疫苗最高提供35%的保护率。

在食源性致病菌的疫苗中，应用最广泛的是传统疫苗，目前研究最热的是基因工程亚单位疫苗和核酸疫苗。基因工程亚单位疫苗具有纯度高、产量高、安全性高的优点，适用于病原菌难于培养或有潜在致癌性的疫苗研究。核酸疫苗较稳定，制备及使用过程简单方便，易于大批量生产，易于贮存和运输，免疫效果持续可靠。

3展望

传统疫苗中，灭活疫苗使用剂量较大，且诱导的免疫反应水平较低，持续时间较短，因而需要多次接种。减毒疫苗有可能在动物体内恢复毒力具有潜在的致病危险，且不易贮存，野生型菌株感染也会导致疫苗效果下降。在实际应用中，因传统疫苗均存在非特异性反应强、保护期短等缺点，这就促使新型疫苗的产生，以期望弥补传统疫苗的不足并最大化兼备传统疫苗的优点。

随着生物技术、免疫技术及基因测序的发展，各种新型基因工程疫苗受到越来越多的关注。但应意识到新型疫苗作为高科技产品，生产成本较高，并涉及基因水平，与人类及环境的健康及安全密切相关，因而在新型疫苗的开发、生产等环节应引起高度重视。

面对食源性致病菌感染率不断上升的趋势，食源性致病菌各类高效、安全、低廉疫苗的研发及推出具有重要的现实意义。随着养殖业生产集约化程度的不断提高，科研投入的增加和检测水平的提高，疫苗的市场需求将逐渐增大。同时，应该进一步探索各类食源性致病菌的感染机理，把试验研究和现实需求结合起来，并充分发挥各种疫苗的优势。相信在可预见的将来，会有更多成本低、制备及使用简单方便、免疫力强、保护期长的新型疫苗诞生，给疾病的预防和治疗带来新的进展与希望。

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[收稿2014-09-25修回2014-10-10]

(编辑许四平)

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