益气化瘀解毒法对慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠APC、beta-catenin表达干预的实验研究※

安 静 杨晋翔 贺梅娟 彭继升 魏 玥 贾雪晴

（1.北京中医药大学，100029 2.北京中医药大学第三附属医院 3.中华中医药学会）

胃癌是一个逐步形成的过程，常由胃癌前病变（PLGC）进一步发展而来。胃癌前病变的早诊断和早干预可以阻断其向胃癌的发展。PLGC分为肠上皮化生（IM）和异型增生（Dys）两种，尤其是中重度异型增生。轻度Dys约15%～30%会进展为重度Dys和／或腺癌，而重度Dys的病人有60%～80%发展为胃癌。有效干预PLGC，阻断其向胃癌的发展，对防治胃癌有积极意义。

中医学将PLGC归为“胃痞”，属本虚标实之证。从微观上辨识有“虚痞”“胃脘痛”“胃痞恶化”之实。以其辨证论治、个体化治疗、多靶点干预、毒副作用小等为特点。中医药疗法可多途径、多环节、多靶点来干预阻断逆转PLGC，逐渐成为治疗PLGC的重要手段。

实验材料

1.实验动物：无特定病原体（Specified Pathogen Free，SPF）Wistar实验用雄性大鼠60只，4周龄，体重约100g。由京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物批号：SCXK（京）2012-0001。

2.实验药物：①消痞颗粒剂：为益气化瘀解毒法方药，由北京中医药大学第三附属医院药剂科制成颗粒冲剂，12g／袋，每克冲剂含生药9g。②维酶素片：为阳性对照组用药，由河北环海药业有限公司生产，产品批号：20090506。③N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍［（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG），又称1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍］：由日本东京化成工业株式会社（Tokyo Chemical Industry Co.Ltd，TCI）生产，CAS登录号：70-25-7，产品编号：M0527。

研究方法

1.模型的建立：参照相关文献［1，2］采用以MNNG癌诱变剂灌胃为主多因素联合建立慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠模型。模型组大鼠自由饮用浓度为0.05%氨水溶液，氨水溶液每24h新鲜配制并更换1次，自由进食含0.03%盐酸雷尼替丁清洁级大鼠饲料，予120μg／mL的MNNG溶液灌胃，每只5mL／kg·d。

2.随机分组：SPF级雄性Wistar大鼠60只经适应性饲养1周，根据体重因素按计算机生成随机数字法随机分为两组。空白组10只，给以清洁级动物标准提供普通饲料喂养，持续至实验结束。造模组50只，如上述造模方法和饲养条件进行干预，于实验第20、24、26、28、30、32周分别随机抽检2只。第32周末造模成功，造模结束。

3.干预处理：第33周始将造模组剩余的33只大鼠考虑体重因素，按计算机生成分层，随机分成三组，每组11只，以清洁级动物标准提供普通饲料和水饲养，自然恢复组予生理盐水3mL／kg·d灌胃；维酶素组予维酶素悬浊液2mL／kg·d（即维酶素0.3g／kg）灌胃；消痞颗粒组予消痞颗粒悬浊液3mL／kg·d（含生药9g／kg）灌胃。干预阶段持续12周。所有实验大鼠于第44周末处死。

4.标本处置：实验第44周末，取材前各组大鼠禁食不禁水18h，使用1%戊巴比妥钠按30mg／kg经腹腔注射麻醉大鼠后，迅速沿大弯侧剪开，4%生理盐水漂洗内容物，再沿小弯侧剪开，用滤纸吸干水分，切取病变胃黏膜组织，取胃窦组织10%甲醛液固定，常规石蜡包埋切片，常规HE染色和免疫组化。

5.观察指标及方法：（1）观察大鼠胃黏膜组织病理组织学诊断及分级。病理分析标准采用2000年中华医学会消化病学分会《全国慢性胃炎研讨会共识意见》［3］和2006年中华医学会消化病学分会全国第二届慢性胃炎共识会议制定的《中国慢性胃炎共识意见》中的病理诊断标准［4］。（2）结果观察和分析方法：使用图像处理分析软件Image-Pro Plus V 7.0（IPP 7.0）软件观察经免疫组化染色后APC和beta-catenin蛋白的表达情况，在高倍镜视野（×40）随机选取5个视野摄像，并使用IPP7.0图像分析软件计算总面积内的平均光密度值做半定量分析。

结果

1.大鼠病理变化情况：全部10例空白组均出现异型增生；自然恢复组大鼠胃黏膜持续萎缩，伴有IM及Dys，未见明显组织修复现象，2例为轻度异型增生，2例为中度异型增生，3例为重度异型增生，仅1例未出现异型增生。维酶素组大鼠胃黏膜可见组织修复现象，2例为轻度异型增生，2例为中度异型增生，2例为重度异型增生，3例出现异型增生逆转。消痞颗粒组大鼠胃黏膜可见明显组织修复现象，2例为轻度异型增生，2例为中度异型增生，0例为重度异型增生，7例出现异型增生逆转。消痞颗粒组大鼠的病理变化情况优于自然恢复组（P＜0.05），维酶素组大鼠的病理变化情况与自然恢复组有差异（P＞0.05）。

2.各组大鼠APC和β-catenin蛋白表达情况：（1）各组大鼠APC蛋白表达：经免疫组化图像半定量分析得出，空白组有10例大鼠APC蛋白表达，自然恢复组有8例，维酶素组有9例，消痞颗粒组有11例。消痞颗粒组大鼠APC蛋白表达情况优于维酶素组（P＜0.05）和自然恢复组（P＜0.01），但与空白组大鼠APC蛋白表达情况仍有差异（P＜0.01）。（2）各组大鼠betacatenin蛋白表达情况：经免疫组化图像半定量分析得出，空白组有10例大鼠beta-catenin蛋白表达，自然恢复组有8例，维酶素组有9例，消痞颗粒组有11例。经统计分析比较，消痞颗粒组大鼠beta-catenin蛋白表达情况明显优于维酶素组（P＜0.01）和自然恢复组（P＜0.01），同时与空白组beta-catenin蛋白表达情况比较，差异无统计学意义（P＜0.01）；维酶素组大鼠beta-catenin蛋白表达情况与自然恢复组比较，没有统计学意义（P＞0.05），与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；自然恢复组大鼠beta-catenin蛋白表达情况与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。（3）大鼠APC蛋白与beta-catenin蛋白表达关系：25例APC蛋白表达阳性的大鼠中有24例beta-catenin蛋白表达阳性，1例beta-catenin蛋白表达阴性；而13例APC蛋白表达阴性的大鼠中，有5例beta-catenin蛋白表达阳性，8例betacatenin蛋白表达阴性。经两变量相关分析检验，P＜0.01，可以认为大鼠APC蛋白与beta-catenin蛋白表达相关。

讨论

PLGC的病机基础为脾胃虚损，兼或气阴两虚。以益气化瘀解毒法为组方的消痞颗粒通过益气养阴消滞、活血化瘀、清热解毒之法不仅改善临床症状，而且消除异化之象，逆转胃癌前病变。

Correa［5］根据病理组织学和流行病学研究将胃癌的发生发展描述为一个连续的组织病理学事件：正常胃黏膜→浅表性炎症→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌。该模式已经得到国内外专家认可。胃癌前病变主要是指萎缩性胃炎伴不完全性肠化生和（或）中、重度异型增生［6］。近些年越来越多的临床资料显示肠上皮化生预测胃癌价值有限而更强调重视肠上皮化生范围。因此，肠上皮化生分型的临床意义和价值有限。

胃上皮异型增生与胃癌的发生和发展密切相关。研究显示，轻度异型增生的癌变率仅为2.27%，重度癌变率是25.00%，中度介于两者之间［7］；轻度异型增生癌变的相对危险度为1.97［8］，中度和重度异型增生癌变的相对危险度分别高达正常人群的26倍和132倍［9］。目前西医学对胃癌前病变的基础研究取得了令人瞩目的成果，但仍缺乏理想阻断或逆转这种病变的有效药物和方法。中医药疗法有其独特优势，大量临床治疗及实验研究表明，中医药疗法［10～12］可使部分肠上皮化生和异型增生减轻或消失，对防治胃癌的发生和发展具有十分重要的意义。

胃癌是一种常见的恶性肿瘤，经过多阶段、多途径协同作用逐步发展形成。本研究探讨益气化瘀解毒法对胃癌前病的较好疗效是通过作用于多基因、多途径实现的，其对Wnt传导通路成分APC、beta-catenin表达的调节是其可能作用机制之一，从而达到防治胃癌的发生和发展的作用。

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