ELISA在植物检疫中的应用及其质量控制

梁新苗 边勇 汪万春 李建光 张伟魏 海燕 刘来福

（北京出入境检验检疫局 北京 100026）

ELISA在植物检疫中的应用及其质量控制

梁新苗 边勇 汪万春 李建光 张伟魏 海燕 刘来福*

（北京出入境检验检疫局 北京 100026）

介绍了ELISA技术在植物病毒、真菌、细菌检测上的应用及进展，并对其质量控制进行了讨论。

ELISA；植物检疫；质量控制

1 前言

酶联免疫吸附技术（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常见的抗原抗体检测技术，它把抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化反应有机地结合起来，用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体），是酶免疫测定技术中应用最广的技术。本文对ELISA的反应类型及其在植物检疫中的应用进行了概述，并对ELISA用于植物检疫质量控制过程中样品的处理、试剂的稳定性、交叉反应及技术操作等注意事项进行了梳理，对存在的问题进行了讨论，以期进一步规范ELISA用于植物检疫中的应用。

2 ELISA在植物检疫中的应用

ELISA具有灵敏度高、特异性强、操作简单等优点，克服了常规血清学方法受病毒浓度、粒子形态和抗血清用量等因素的限制，目前在植物检疫中得到了广泛的应用。

2.1ELISA在植物病毒检测上的应用

2.1.1检测植物病毒抗原

1976年，Voller等［1］将ELISA技术应用于苹果花叶病毒（Apple Mosaic Virus，ApMV）的检测，Clark等［2］将ELISA技术应用于南芥菜花叶病毒（Arabis Mosaic Virus，ArMV）和李痘病毒（Plum Pox Virus，PPV）的检测，标志着ELISA技术正式应用到植物病毒。

马铃薯卷叶病毒（Potato Leaf Roll Virus，PLRV）在植物中的含量很低，很难用其他血清学方法对其植株粗汁液当中的病毒进行检测。Casper的研究表明，ELISA技术可以用于检测PLRV，同时还可以定量分析该病毒在寄主植物不同器官中的分布及相对浓度。

ELISA技术还可以用于检测单粒种子中的病毒。目前在烟草环斑病毒（Tobacco Ringspot Virus，TRSV）、大麦条纹花叶病毒（Barley Stripe Mosaic Virus，BSMV）、大豆花叶病毒（Soybean Mosaic Virus，SMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）、烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber Green Mottle Mosaic Virus，CGMMV）等的单粒种子检测上均得到很好效果。

Bossennec［3］在对SMV的研究中发现，ELISA技术还可用于测定单粒种子不同部位带毒情况。将大豆种子的不同部位用解剖刀分成大豆胚芽、胚根、胚乳、种皮等，每个部位分别进行处理后进行ELISA检测，结果表明在不同部位均可检测到SMV。种子各部分抗原最高稀释500-2000倍仍可检测出其中的病毒。

目前，很多种植物病毒在不同方面、不同程度上都可以成功地进行ELISA试验，张成良等［4］分析了已报道的50种植物病毒应用ELISA诊断的研究资料，表明ELISA技术的使用范围很广，可以覆盖国内外已报道的所有病毒形态的病毒，如球状、线状、杆状、弹状和杆菌状、分枝丝状体等，并且受实验材料的限制性较小，其在植物病毒上的应用具有广阔前景。

2.1.2检测植物病毒间的亲缘关系

ELISA技术具有专化性强的优点，非常适合于研究植物病毒间的血清学亲缘关系。Koenig［5］对26个病毒样品进行了同源反应和异源反应试验，结果表明ELISA对植物病毒的株系有高度的选择性，不仅可以测定不同病毒之间的亲缘关系以及株系关系，还可以测定亲缘关系很近的病毒的分化。Clark等使用间接ELISA进行同源反应和异源反应试验，得到抗体反应曲线，对植物病毒的血清学关系进行研究。对获得的数据进行回归分析，从而确定不同病毒-抗体组合的亲缘关系。

ELISA技术还可以对同一病毒的不同血清类型进行区分。Barbara等［6］使用ELISA技术对酒花及李树上的李坏死环斑病毒株系进行了快速检测及血清学分型；李彦勇［7］应用直接ELISA和间接ELISA对来自不同国家和地区的10个芜菁花叶病毒（Turnip Mosaic Virus，TuMV）株系或分离物间的血清学关系进行了比较试验，结果表明间接ELISA技术较直接ELISA技术更适用于广谱的病毒诊断及株系鉴定。

2.1.3植物病毒流行病学分析

利用ELISA对植物病毒的分布情况进行追踪调查，研究植物病毒变异株系的地域性，对植物流行病学的研究具有指导意义。李瑛等［8］利用ELISA对兰州百合病毒进行检测，发现兰州百合病毒含量随着种植年限的增加而增加；施曼玲等［9］利用三抗体夹心ELISA对芜菁花叶病毒进行了检测，测定出7种农作物上有TuMV感染；赵荣乐等［10］从新疆感病的萝卜（Raphanus sativus）上分离到一种线状病毒，染病组织粗汁液和提纯病毒制备物在ELISA检测中与芜菁花叶病毒抗血清发生强烈的免疫反应，证明该病毒株应属于芜菁花叶病毒的一个株系；孙清等应用间接ELISA对采自河南省中部烟区的花叶病标样进行检测；谭雪莲等采用DAS-ELISA检测方法对甘肃地区葡萄主要品种进行扇叶病毒和卷叶病毒的调查和测定。

2.1.4检测介体昆虫内的病毒

昆虫介体传播是植物病毒自然传播的主要途径，因此对昆虫介体的准确、快速检测对植物病毒的早期诊断、病情预测预报和及时采取防治措施具有重要意义。常规的昆虫介体带毒检测方法步骤繁琐、检测数量有限、实验周期长且准确性差，使用ELISA技术对介体昆虫进行检测则可克服上述缺点，为定量研究昆虫介体体内的病毒含量及分布提供了可能。

Clarke等使用ELISA技术不仅检测了马铃薯块茎中的马铃薯卷叶病毒，同时还从携带PLRV的桃蚜体内检测到PLRV。豌豆长管蚜是豌豆耳突花叶病毒（Pea Enation Mosaic Virus，PEMV）的传毒介体，Denis Fargette等［11］使用ELISA技术对豌豆长管蚜的单个蛹及成虫进行检测，ELISA技术检测PEMV的灵敏度为在5 ng/mL，单头豌豆长管蚜体内含1 ng的PEMV时仍可被检出。

2.1.5用于样品的初步筛查

对于大规模样品的检测，可以先使用ELISA方法对样品进行初步筛查，用于区分阴性和阳性样品，之后再将ELISA检测得到的阳性样品或弱阳性样品进一步进行分子生物学技术检测，从而验证样品中是否含有待检病毒。

2.2ELISA在植物细菌检测上的应用

宁红等［12］用ELISA技术进行水稻细菌性条斑病菌的研究，研究表明从制样到完成检测约需40 h。检测结果不但可以目测定性，还可用酶联免疫检测仪所测得的OD值在试验制作的曲线上查出稻谷带菌量。杨苏声等［13］用ELISA对大豆根瘤菌的鉴定中，发现该法能够特异地检测和区别慢生型和快生型大豆根瘤菌；ELISA的最低检测浓度为2×105细胞/mL；在冰箱低温（-20℃）和硅胶干燥常温条件下保存根瘤，均不影响ELISA的检测效果，灵敏度不降低。姜荣文等［14］采用ELISA技术测定了我国根瘤菌株与引进菌株NC92的血清型异同和大田接种花生后的结瘤比率，并比较了限定培养基和YMA培养基培养制备的抗原-抗体反应。

2.3ELISA在植物真菌检测上的应用

随着其他新方法的出现，ELISA在真菌检测领域应用的研究逐渐减少。窦坦德等［15］在快速检测大豆疫霉菌的酶联免疫吸附技术研究中，发现间接法（I-ELISA）和双抗夹心法（DAS-ELISA）都能较好地检测纯培养的大豆疫霉菌，但在检测病组织时，DAS-ELISA的特异性更强，能够可靠地检测到大豆病组织内的病原菌。马贵龙等［16］制备了烟草赤星病菌的抗血清，用ELISA间接法对烟草种子进行检测，结果表明：制备的抗体球蛋白IgG对来自吉林省内5个市县的8个烟草赤星病菌株全部呈阳性反应，而对Alternaria cuucumerina和Alternaria porri则呈阴性反应，对种子分离得到的Fusarium sp.和Phyllosticta sp.等4种真菌及烟草野火病菌和Xanthomonas sp.均呈阴性反应，表明该抗体球蛋白IgG的特异性很强。对7种不同浓度孢子悬液接种花器所获种子进行检测，与种子分离培养结果一致。因此，ELISA法对于检测烟草种子是否带有赤星病菌是一种快速而准确的方法。

3 ELISA的质量控制关键点

ELISA具有灵敏度高、特异性强、快速、简便等特点，并且易于自动化，应用非常广泛。但由于ELISA在应用过程中还存在很多难点，因此必须进行质量控制才能保证其检测结果准确。ELISA质量控制是一个复杂的过程，有很多影响因素。

3.1人员

进行ELISA检测的人员应进行培训，对包括ELISA原理、试剂性能、仪器使用、操作规程等内容熟练掌握。

3.2试剂

试剂质量在很大程度上决定了检测的水平，因此在引入新项目之前必须对试剂进行严格评估。必须选择和订购质量稳定、可靠的试剂，并保证保存条件。例如植物病毒检测常用的试剂公司来源有AGDIA、ACD和ADI；对于有效期短、使用率低的试剂，应当小量分装，避免反复冻融造成试剂的失效；试剂使用前必须平衡至室温，否则会影响检测下限；未用完的质控样品及本次不需使用的试剂应密封并及时放回冰箱保存。

3.3样品

样品应尽量避免细菌污染。细菌菌体中可能含有内源酶对测定产生非特异性干扰，还可能对抗原抗体等蛋白产生分解作用。若样品在保存过程中出现浑浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清进行检测。样品的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对蛋白等分子产生破坏作用，使抗体效价跌落从而引起假阴性结果［17］。标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩造成分布不均，因此重新融解的标本必须混匀，但不要进行剧烈振荡，反复颠倒即可。

3.4操作步骤

ELISA的操作步骤复杂，主要包括包被、洗板、加样、温育、读板等步骤，现就各步骤的主要影响因素进行分析。

3.4.1加样

必须定期对加液器进行维护和校准。加不同的标本时需更换枪头，以免发生交叉污染。加样时速度不可太快，避免将样品加在孔壁上部，并注意不要溅出或产生气泡。加样时还应注意操作时差对结果的影响，操作时差是指加入标本、试剂及混匀时间的差异。由于存在边缘效应，避免将样品加在酶联板的边缘。

3.4.2温育

抗原抗体反应的完成需要一定温度和时间，这一保温过程称为温育。植物病毒检测中常采用的温育温度有37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中最常用的温育温度，也是大多数抗原抗体结合的最适反应温度。植物病毒检测常用的温育方式有温箱法、水浴法等，其中水浴法能较好解决因受热不均衡所致的周围孔与中央孔结果的吸光度差异（这种现象被称为“边缘效应”）。严谨的ELISA试剂盒一般都规定了明确的温育温度，若要求室温温育，则一般是指20℃-25℃。

3.4.3洗涤

ELISA检测过程中，要进行多次洗涤，因此洗涤是一个很重要的操作，通过彻底洗涤，除去未被结合的抗原、抗体或结合物，防止它们和随后加入的相对应的抗体、结合物或者底物等发生干扰反应。洗涤操作要求严格、一致，使每一个反应孔都用同样方法严格清洗。洗涤的方法很多，洗涤液可用生理盐水或PBS，但一般多在洗液中加入吐温，以避免非特异性吸附。除了加入吐温，还可加入牛血清蛋白或白明胶。叠氮化钠作为一种保护性阻断剂，用量应适当，否则影响反应强度。

3.4.4显色

显色是ELISA中的最后一步温育反应，底物浓度是影响显色反应的最重要的条件之一。在底物浓度不是过高时，反应速度与底物的浓度成正比；当底物浓度很高时，反应速度趋近最大值，此时，再增加底物浓度反应速率不再增加。研究表明，显色受时间和温度的影响，一般37℃反应30 min可使显色充分，如果缩短反应时间或者降低反应温度均可影响检测的下限。为了保证结果的稳定性，必须固定显色时间和温度，但不少操作者往往忽略了这一点。

4 结语

ELISA技术在近几年高速发展，已成为21世纪最具竞争力和挑战性的检测分析新技术之一。ELISA检测所需仪器化程度低、操作简便、对样本预处理要求简单、易于推广，具有特异性强、灵敏度高、快速、经济等特点，并且对环境无污染，它已成为主要的免疫学检测技术，得到了快速发展和广泛应用，其应用覆盖范围也在不断壮大。在植物检疫领域，ELISA在检测植物病毒抗原、检测病毒间亲缘关系、植物病毒的流行病学分析、样品初筛、植物细菌检测以及植物真菌检测等方面均得到广泛的应用。另外，在生态学研究中，利用ELISA技术检测捕食作用，研究并分析食物关系，可以帮助更好地理解和预测生态系统的一些基本过程，更好地了解相互作用的多物种系统的多样性格局和动态，为害虫管理提供新思路。

［1］Voller A，Bartlett A，et al.The detection of viruses by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）［J］.J Gen Virol，1976，33（1）：165-167.

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Application and Quality Control of ELISA in Plant Quarantine

Liang Xinmiao，Bian Yong，Wang Wanchun，Li Jianguang，Zhang Wei，Wei Haiyan，Liu Laifu*
（Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing，100026）

The application and progress of ELISA in plant virus，fungi and bacterium are presented，and the quality control of ELISA in plant quarantine is discussed.

ELISA；Plant Quarantine；Quality Control

R446.61

E-mail：liangxm@bjciq.gov.cn；*通讯作者E-mail：liulf@bjciq.gov.cn

国家质检总局科技计划项目（2013IK306）

2015-06-09